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雷公藤內酯醇衍生物及其應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN03102976.0

申請日:

2003.01.23

公開號:

CN1511838A

公開日:

2004.07.14

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情:

專利權人的姓名或者名稱、地址的變更IPC(主分類):C07D 493/22變更事項:專利權人變更前:中國科學院上海藥物研究所變更后:中國科學院上海藥物研究所變更事項:地址變更前:201203 上海市浦東張江祖沖之路555號變更后:201203 上海市浦東張江祖沖之路555號變更事項:共同專利權人變更前:上海市醫藥股份有限公司變更后:上海醫藥集團股份有限公司|||專利權的轉移IPC(主分類):C07D 493/22變更事項:專利權人變更前權利人:中國科學院上海藥物研究所變更后權利人:中國科學院上海藥物研究所變更事項:地址變更前權利人:201203 上海市浦東張江祖沖之路555號變更后權利人:201203 上海市浦東張江祖沖之路555號變更事項:共同專利權人變更前權利人:上海醫藥(集團)有限公司變更后權利人:上海市醫藥股份有限公司登記生效日:20100416|||專利申請權、專利權的轉移(專利權的轉移)變更項目:專利權人變更前權利人:中國科學院上海藥物研究所 地址: 上海市太原路294號變更后權利人:中國科學院上海藥物研究所 地址: 上海市浦東張江祖沖之路555號 郵編: 201203; 上海醫藥(集團)有限公司 地址: 上海市太倉路200號 郵編: 200020登記生效日:2006.3.24|||授權|||實質審查的生效|||公開

IPC分類號:

C07D493/22; A61K31/34; A61P37/02; A61P37/08; A61P37/06; A61P9/10; A61P17/00

主分類號:

C07D493/22; A61K31/34; A61P37/02; A61P37/08; A61P37/06; A61P9/10; A61P17/00

申請人:

中國科學院上海藥物研究所;

發明人:

李援朝; 左建平; 張凡; 周茹; 丁建

地址:

上海市太原路294號

優先權:

2002.12.27 CN 02160524.6

專利代理機構:

隆天國際知識產權代理有限公司

代理人:

樓仙英

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內容摘要

式(I)所示雷公藤內酯醇衍生物、其藥學上可接受的鹽及光學異構體(其中C5和C6以碳碳單鍵或碳碳雙鍵相連;當C5和C6以碳碳單鍵相連時,X和Y分別表示連接在C5位和C6上的氫、氧、羥基、鹵素、低級烷氧基、低級烷胺基、巰基、低級烷巰基、式-OCOR所示基團、-OSO2OR所示基團或-OPO(OH)2所示基團,R表示-(CH2)nCO2Na、-(CH2)nCO2K或-(CH2)nCH3,n=1-6;Z表示連接在C14位上的氫、氧、羥基、鹵素、低級烷氧基、低級烷胺基、巰基、低級烷巰基、式-OCOR所示基團、-OSO2OR所示基團或-OPO(OH)2所示基團,R表示-(CH2)nCO2Na、-(CH2)nCO2K或-(CH2)nCH3,n=1-6;式中,連接X,Y,Z的——可代表“”或者“”;但是,X、Y不可同時為氫原子),其合成方法和作為抗炎劑、免疫抑制劑或相關性疾病治療劑的應用。

權利要求書

1: 通式(1)所示雷公藤內酯醇衍生物或其藥學上可接受的鹽或它們的光學 異構體: 其中C 5 和C 6 以碳碳單鍵或碳碳雙鍵相連; 當C 5 和C 6 以碳碳單鍵相連時,X和Y分別表示連接在C 5 位和C 6 上的氫、 氧、羥基、鹵素、低級烷氧基、低級烷胺基、巰基、低級烷巰基、式-OCOR 所示基團、-OSO 2 OR所示基團或-OPO(OH) 2 所示基團,這里R表示 -(CH 2 ) n CO 2 Na、-(CH 2 ) n CO 2 K或-(CH 2 ) n CH 3 ,n=1-6; Z表示連接在C 14 位上的氫、氧、羥基、鹵素、低級烷氧基、低級烷胺基、 巰基、低級烷巰基、式-OCOR所示基團、-OSO 2 OR所示基團或-OPO(OH) 2 所 示基團這里R表示-(CH 2 ) n CO 2 Na、-(CH 2 ) n CO 2 K或-(CH 2 ) n CH 3 ,n=1-6; 在上式中,連接X,Y,Z的——可代表 或者 但是,X,Y不可同時為氫原子。
2: 如權利要求1所述的雷公藤內酯醇衍生物,其中X為α(R)構型,Y 為R或S構型,Z=β-OH(R)構型。
3: 如權利要求1所述的雷公藤內酯醇衍生物,其中X為α(R)構型,Y 為R或S構型,Z=α-OH(S)。
4: 如權利要求1所述的雷公藤內酯醇衍生物,其中X為α(R)構型,Y 為R或S構型,Z=O。
5: 如權利要求1所述的雷公藤內酯醇衍生物,其中C 5 和C 6 為雙鍵,Z 為R或S構型或者Z=O。
6: 如權利要求1所述的雷公藤內酯醇衍生物,所述衍生物為: (5R)-5-羥基雷公藤內酯酮; (5R)-5-羥基雷公藤內酯醇; (5R)-5-羥基表雷公藤內酯醇; Δ5,6-脫氫雷公藤內酯酮; Δ5,6-脫氫雷公藤內酯醇; Δ5,6-脫氫表雷公藤內酯醇; (5R,6S)-5,6-環氧雷公藤內酯酮; (5R,6S)-5,6-環氧雷公藤內酯醇; (5R,6S)-5,6-環氧表雷公藤內酯醇; 順式-(5R,6S)-5,6-雙羥基雷公藤內酯酮; 順式-(5R,6S)-5,6-雙羥基雷公藤內酯醇;或 順式-(5R,6S)-5,6-雙羥基表雷公藤內酯醇。
7: 權利要求1所述雷公藤內酯醇衍生物在制備抗炎劑、免疫抑制劑或治 療相關性疾病的藥物上的應用。
8: 如權利要求7所述的應用,其中所述相關性疾病包括自身免疫性疾病、 感染性疾病、嚴重過敏性疾病、各種皮膚疾病、心血管系統疾病、器官移植后 的抗排異反應,以及抗生育等與機體免疫系統的功能及反應狀態異常有關的疾 病。

說明書


雷公藤內酯醇衍生物及其應用

    【技術領域】

    本發明涉及天然藥物活性成分的結構改造及活性研究,具體涉及雷公藤二萜類內酯—雷公藤內酯醇衍生物的合成及抗炎免疫抑制等藥理活性的研究。

    背景技術

    雷公藤Tripterygium?Wilfordii?Hook?f系衛矛科雷公藤屬木質藤本植物,生于山地林緣陰濕處,分布于長江流域以南各地及西南地區,其化學成分主要是二萜、三萜、倍半萜、生物堿等。近二十年來的研究表明雷公藤具有抗炎、免疫抑制、抗生育、抗腫瘤、抗菌等活性,特別是在免疫抑制作用方面,雷公藤中下式所示的二萜類內酯雷公藤內酯醇(triptolide)具有很強的藥理活性。

    但是雷公藤內酯醇(triptolide)的毒副作用,限制了其在臨床上的應用。本發明者通過對雷公藤內酯醇構效關系的潛心研究,對其結構進行改造和修飾,獲得了一批新型的雷公藤內酯醇的結構類似物,從而完成了本發明。

    【發明內容】

    本發明的一個目的是提供高效、低毒的雷公藤內酯醇衍生物。

    本發明的另一個目的是提供雷公藤內酯醇衍生物在制備抗炎劑、免疫抑制劑和治療相關疾病的藥物上的應用。

    本發明提供的雷公藤內酯醇衍生物是通式(1)所示化合物或其藥學上可接受的鹽或它們的光學異構體:

    其中C5和C6以碳碳單鍵或碳碳雙鍵相連;

    當C5和C6以碳碳單鍵相連時,X和Y分別表示連接在C5位和C6上的氫、氧、羥基、鹵素、低級烷氧基、低級烷胺基、巰基、低級烷巰基、式-OCOR所示基團、-OSO2OR所示基團或-OPO(OH)2所示基團,這里R表示-(CH2)nCO2Na、-(CH2)nCO2K或-(CH2)nCH3,n=1-6;

    Z表示連接在C14位上的氫、氧、羥基、鹵素、低級烷氧基、低級烷胺基、巰基、低級烷巰基、式-OCOR所示基團、-OSO2OR所示基團或-OPO(OH)2所示基團,這里R表示-(CH2)nCO2Na、-(CH2)nCO2K或-(CH2)nCH3,n=1-6;

    在上式中,連接X,Y,Z的——可代表或者

    但是,X,Y不可同時為氫原子。

    本發明一個優選實施方案是通式(1)中X為α(R)構型、Y為R或S構型、Z=β-OH(R)構型的雷公藤內酯醇衍生物,即如下通式(2)所示化合物:

    其中,X和Y定義如上。

    本發明另一個優選實施方案是通式(1)中X為α(R)構型、Y為R或S構型、Z=α-OH(S)構型的雷公藤內酯醇衍生物,即如下通式(3)所示化合物:

    其中,X和Y定義如上。

    本發明再一個優選實施方案是通式(1)中X為α(R)構型、Y為R或S構型、Z=O的雷公藤內酯醇衍生物,即如下通式(4)所示化合物:

    其中,X和Y定義如上。

    本發明還有一個優選實施方案是通式(1)中C5和C6為雙鍵、Z為R或S構型或者Z=O的雷公藤內酯醇衍生物,即如下通式(5)所示化合物:

    其中,Z定義如上。

    本發明地雷公藤內酯醇衍生物的合成流程示意如下:

    例如,以雷公藤內酯酮為起始物,在非質子極性溶劑中,于加熱條件下,由二氧化硒羥基化得到(5R)-5-羥基雷公藤內酯酮(LLDT-13);再在質子極性溶劑中還原得到(5R)-5-羥基雷公藤內酯醇(LLDT-8)和(5R)-5-羥基表雷公藤內酯醇(LLDT-14);將(5R)-5-羥基雷公藤內酯酮在非質子極性溶劑中以三氟乙酸酐脫水,得到Δ5,6-脫氫雷公藤內酯酮(LLDT-15),然后在質子極性溶劑中還原得到Δ5,6-脫氫雷公藤內酯醇(LLDT-18)和Δ5,6-脫氫表雷公藤內酯醇(LLDT-19);以Δ5,6-脫氫雷公藤內酯酮為原料,在極性溶劑中與過氧試劑發生5,6位環氧化反應,得到(5R,6S)-5,6-環氧雷公藤內酯酮(LLDT-16);再在質子極性溶劑中還原得到(5R,6S)-5,6-環氧雷公藤內酯醇(LLDT-20)和(5R,6S)-5,6-環氧表雷公藤內酯醇(LLDT-21);由Δ5,6-脫氫雷公藤內酯酮開始,在極性溶劑中通過四氧化鋨或鋨酸催化的5、6位雙羥基化反應,生成順式-(5R,6S)-5,6-雙羥基雷公藤內酯酮(LLDT-17);再在質子極性溶劑中還原得到順式-(5R,6S)-5,6-雙羥基雷公藤內酯醇(LLDT-22)和順式-(5R,6S)-5,6-雙羥基表雷公藤內酯醇(LLDT-23)。

    本說明書中所用的術語具有如下意義:

    “低級“指碳原子數為1-6個的直鏈或支鏈碳鏈;

    “烷氧基”可為甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、異戊氧基、叔戊氧基、新戊氧基、2-甲基丁氧基、1,2-二甲基丙氧基、1-乙基丙氧基、己氧基等,以甲氧基和乙氧基為佳;

    “烷胺基”可為甲胺基、乙胺基、丙胺基、異丙胺基、丁胺基、異丁胺基、仲丁胺基、叔丁胺基、戊胺基、異戊胺基、叔戊胺基、新戊胺基等一低級烷胺基,或二甲胺基、二乙胺基、二丙胺基、二異丙胺基、二丁胺基、二異丁胺基等二低級烷胺基,這些基團中較好的為甲胺基、乙胺基、二甲胺基和二乙胺基;

    “烷巰基”可為甲巰基、乙巰基、丙巰基、異丙巰基、丁巰基、異丁巰基、仲丁巰基、叔丁巰基、戊巰基、異戊巰基、叔戊巰基、新戊巰基、2-甲基丁巰基、1,2-二甲基丙巰基、1-乙基丙巰基、己巰基等,以甲巰基和乙巰基為佳;

    “極性溶劑”為例如乙酸乙酯,二氧六環,丙酮,叔丁醇等。

    “非質子極性溶劑”指例如二甲亞砜、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、三氯甲烷、四氫呋喃、二氧六環、乙二醇雙甲醚等。

    “質子極性溶劑”指例如甲醇,乙醇、丙醇、叔丁醇等。

    “加熱條件”指室溫以上至溶劑回流溫度。

    “過氧試劑”為例如間氯過氧苯甲酸、過氧叔丁醇、雙氧水等。

    “藥學上可接受的鹽”具體地可列舉與丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸等有機酸和天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成酯后再與無機堿形成的鹽,如鈉、鉀、鈣、鋁鹽和銨鹽,或與有機堿形成的鹽,如甲胺鹽、乙胺鹽、乙醇胺鹽等,或與賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸等堿性氨基酸形成酯后的鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機酸的鹽,或與甲酸、乙酸,苦味酸、甲磺酸、乙磺酸等有機酸的鹽。

    “光學異構體”的含義包括對映異構體、非對映異構體、光學異構體的混合物及純光學異構體。

    本發明的雷公藤內酯醇衍生物、其藥學上可接受的鹽或光學異構體可制成含活性成分0.001-99.9%(重量)以及適量藥學上可接受的載體的各種制劑,如適合于口服、注射或腸道給藥使用的制劑形式。

    可根據受治療者的年齡(月齡或周齡)、一般健康狀況、疾病嚴重程度和病程、給藥途徑、個體對藥物的敏感性等對受治療者施用含治療有效量本發明化合物的藥物制劑。

    【附圖說明】

    圖1是雷公藤內酯醇(LLDT-2)對淋巴細胞的細胞毒性圖示。

    圖2是(5R)-5-羥基雷公藤內酯醇(LLDT-8)對淋巴細胞的細胞毒性圖示。

    圖3是LLDT-8抑制ConA誘導的T淋巴細胞增殖反應圖示。

    圖4是LLDT-2抑制ConA誘導的T淋巴細胞增殖反應圖示。

    圖5是CsA抑制ConA誘導的T淋巴細胞增殖反應圖示。

    圖6是LLDT-8抑制LPS誘導的B淋巴細胞增殖反應圖示。

    圖7是LLDT-2抑制LPS誘導的B淋巴細胞增殖反應圖示。

    圖8是CsA抑制LPS誘導的B淋巴細胞增殖反應圖示。

    圖9是LLDT-8抑制B6抗Balb/c混合淋巴細胞增殖反應圖示。

    圖10是CsA抑制B6抗Balb/c混合淋巴細胞增殖反應圖示。

    圖11是LLDT-8對大鼠佐劑性關節炎繼發性病變的防治作用圖示。

    圖12是顯示LLDT-8防治佐劑性關節炎效果的照片。圖中,A)為正常大鼠對照組;B)為關節炎模型組;C)-E)分別為LLDT-8如下劑量組:3mg/kg、1mg/kg、0.2mg/kg;F)為CsA?10mg/kg。

    圖13是LLDT-8對大鼠佐劑性關節炎多發性病變的防治作用(四肢臨床癥狀觀測)圖示。

    圖14是LLDT-8改善大鼠佐劑性關節炎體重減輕作用圖示。

    圖15是LLDT-8抑制佐劑性關節炎大鼠B淋巴細胞對LPS誘導的增殖反應的效果圖示。

    圖16是LLDT-8對大鼠佐劑性關節炎繼發性病變的治療作用圖示。

    圖17是LLDT-8對大鼠佐劑性關節炎多發性病變的治療作用(四肢臨床癥狀觀測)圖示。

    圖18是LLDT-8對牛II型膠原誘導的DBA/l小鼠關節炎的治療作用圖示。

    圖19是顯示LLDT-8對牛II型膠原誘導的DBA/l小鼠關節炎治療效果的照片。

    圖20是不同劑量LLDT-8對牛II型膠原誘導的DBA/l小鼠關節炎的治療作用圖示。

    圖21是LLDT-8抑制DBA/l關節炎小鼠抗牛II型膠原特異性抗體產生的圖示。

    【具體實施方式】

    下面結合實施例對本發明作進一步闡述,但這些實施例絕不是對本發明的任何限制。

    實施例1??(5R)-5-羥基雷公藤內酯酮

    將雷公藤內酯酮(374mg,1.04mmol)溶解在20ml二甲亞砜中,然后加入SeO2(461mg,4.16mmol),加熱微回流10小時。反應體系冷卻至室溫,過濾,乙酸乙酯洗滌濾渣,洗滌液與濾液合并,減壓蒸去溶劑。殘渣用飽和Na2CO3溶解,乙酸乙酯萃取,有機相用水和飽和食鹽水洗滌,無水硫酸鈉干燥,減壓蒸去溶劑,得白色固體(5R)-5-羥基雷公藤內酯酮(319mg,0.85mmol,產率82%)。

    1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ4.88(m,2H),4.11(d,J=2.9Hz,1H),4.08(d,J=2.9Hz,1H),3.42(d,J=4.4Hz,1H),2.24(七重峰,J=6.9zHz,1H),1.96-2.20(m,4H),1.83(ddd,J=6.4,11.7,11.8Hz,1H),1.08(寬,dd,J=5.2,12.4Hz,1H),0.91(s,3H),0.88(d,J=6.9Hz,3H),0.78(d,J=6.9Hz,3H);13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ198.4,173.2,161.9,124.5,69.9,68.7,65.1,64.2,61.0,59.0,58.7,56.0,29.7,25.5,24.2,18.0,16.8,16.3,16.0;IR(KBr)3508,2962,1765,1709,1040cm-1;LRMS(EI,70eV)m/z?374(M+,9),331(35),217(43),191(50),113(100);mp?244-246℃(分解)。

    實施例2??(5R)-5-羥基雷公藤內酯醇和(5R)-5-羥基表雷公藤內酯醇

    在0℃,向用5mL甲醇溶解的(5R)-5-羥基雷公藤內酯酮(20mg,0.053mmol)的懸濁液中加入NaBH4(8mg,0.21mmol),攪拌反應2小時,反應體系變為無色澄清溶液,減壓蒸去溶劑,殘渣用乙酸乙酯溶解,用水和飽和食鹽水分別洗滌,無水硫酸鈉干燥,減壓蒸干溶劑,殘渣用柱層析分離(洗脫劑:環己烷∶乙酸乙酯=1∶1),得(5R)-5-羥基雷公藤內酯醇(7.5mg,0.02mmol,產率38%)和(5R)-5-羥基表雷公藤內酯醇(11.3mg,0.03mmol,產率56%)。

    (5R)-5-羥基雷公藤內酯醇:

    1H-NMR(DMSO-d6,400Hz)δ5.32(s,1H),4.87(m,2H),4.57(br.s,1H),3.73(d,J=2.9Hz,1H),3.53(d,J=2.9Hz,1H),3.38(s,1H),3.34(d,J=5.0Hz,1H),2.07-2.19(m,4H),1.94-2.06(m,1H),1.76(ddd,J=6.4,11.6,11.9Hz,1H),1.05(dd,J=5.3,12.4Hz,1H),0.99(s,3H),0.90(d,J=6.9Hz,3H),0.77(d,J=6.9Hz,3H);13C-NMR(DMSO-d6,100Hz)173.2,162.7,124.1,71.0,69.7,68.6,63.9,62.6,61.4,58.7,55.9,54.0,30.3,27.3,23.1,17.6,16.8,16.6,16.3;IR(KBr)3467,2962,1765,1433,1030cm-1;MS(EI,70eV)m/z377(M+1,3),343(4),329(22),287(27),163(30),71(47),43(100);mp?240-242℃(分解)。

    (5R)-5-羥基表雷公藤內酯醇:

    1H-NMR(DMSO-d6,400Hz)δ5.32(br.s,1H),4.89(m,2H),4.14(br.s,1H),3.72(d,J=2.9Hz,1H),3.58(d,J=5.1Hz,1H),3.45(d,J=2.9Hz,1H),2.23(七重峰,J=6.9Hz,1H),1.99-2.19(m,4H),1.79(ddd,J=6.6,11.7,12.1Hz,1H),1.07(m,1H),0.99(s,3H),0.97(d,J=6.9Hz,3H),0.70(d,J=6.9Hz,3H);13C-NMR(DMSO-d6,100Hz)δ173.2,162.8,124.0,69.6,68.6,65.5,65.3,63.8,62.0,56.5,53.4,52.1,30.1,26.7,23.6,19.0,16.8,16.2,15.6;IR(KBr)3458,3392,2955,1751,1030cm-1;MS(EI,70eV)m/z376(M+,8),359(41),273(46),193(55),71(100);mp238-240℃(分解)。

    實施例3??Δ5,6-脫氫雷公藤內酯酮

    將(5R)-5-羥基雷公藤內酯酮(224mg,0.60mmol)加入無水吡啶(4ml,50.57mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中,攪拌溶解,然后在5分鐘內滴加三氟乙酸酐(600mg,2.85mmol),室溫下反應12小時,薄層層析(環己烷∶乙酸乙酯=1∶1)檢查原料消失后,終止反應,減壓蒸去溶劑,殘渣用水(20ml)稀釋,加乙酸乙酯(40ml×3)萃取,有機相分別用稀硫酸、飽和碳酸氫鈉溶液和飽和食鹽水洗滌,無水硫酸鈉干燥,蒸去溶劑,得棕黃色油狀物,柱層析分離(洗脫劑:環己烷∶乙酸乙酯=3∶1),環己烷—乙酸乙酯重結晶,得白色晶體Δ5,6-脫氫雷公藤內酯酮(166mg,0.47mmol,產率75%)。

    1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ6.01(d,J=3.7Hz,1H),4.90(m,2H),4.01(d,J=2.9Hz,1H),3.84(d,J=2.9Hz,1H),3.47(d,J=3.7Hz,1H),2.46-2.51(m,1H),2.44(七重峰,J=6.9Hz,1H),2.24-2.36(m,1H),1.50(d,J=3.7Hz,1H),1.47-1.49(m,1H),1.31(s,3H),0.99(d,J=6.9Hz,3H),0.89(d,J=6.9Hz,3H);13C-NMR(CDCl3,100MHz)δ196.3,172.7,152.5,141.0,127.7,120.0,68.8,66.3,65.3,64.5,59.6,56.5,55.6,37.1,30.3,25.6,22.9,18.0,17.1,16.3;IR(KBr)3432,2960,2850,1762,1724,1433,1356,1038cm-1;MS(EI,70eV)m/z356(M+,21),338(31),323(43),285(87),257(89),128(96),115(100);mp?242-244℃(分解)。

    實施例4??(5R,6S)-5,6-環氧雷公藤內酯酮

    將Δ5,6-脫氫雷公藤內酯酮(280mg,0.78mmol)溶解在10ml無水二氯甲烷中,加入70-75%間氯過氧苯甲酸(500mg,2.03mmol),加熱回流反應6小時,加入5%硫代硫酸鈉溶液終止反應,加入二氯甲烷30ml稀釋反應體系,分出有機相,水相用二氯甲烷20ml分別提取兩次,合并有機相,分別用飽和碳酸氫鈉溶液和飽和食鹽水洗滌,無水硫酸鈉干燥,減壓蒸去溶劑,殘渣柱層析分離(洗脫劑:環己烷∶乙酸乙酯=4∶1),得白色固體(5R,6S)-5,6-環氧雷公藤內酯酮(220mg,0.59mmol,產率75%)。

    1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ4.63(m,2H),3.91(d,J=2.9Hz,1H),3.84(d,J=2.9Hz,1H),3.81(d,J=2.2Hz,1H),3.62(d,J=2.2Hz,1H),2.47-2.52(m,1H),2.38(七重峰,J=6.9Hz,1H),2.26-2.33(m,1H),1.69(dt,J=6.2,12.0Hz,1H),1.50-1.57(m,1H),1.28(s,3H),0.96(d,J=6.9Hz,3H),0.86(d,J=6.9Hz,3H);13C-NMR(CDCl3,100MHz)δ195.5,171.8,153.9,134.0,67.8,66.7,63.1,62.3,60.3,59.6,58.1,56.7,55.8,36.3,27.3,25.6,17.9,17.6,17.5,16.3;IR(KBr)3446,2966,1766,1732,1431,1229,1038cm-1;MS(EI,70eV)m/z372(M+,6),357(13),329(4),231(100),203(12),187(9);mp?252-254℃(分解)。

    實施例5??順式-(5R,6S)-5,6-雙羥基雷公藤內酯酮

    將Δ5,6-脫氫雷公藤內酯酮(72mg,0.20mmol)溶解于3.2ml二氧六環中,然后在攪拌下在該體系中加入1.6ml水、K3Fe(CN)6(250mg,0.76mmol)、K2CO3(100mg,0.72mmol)以及OsO4(2.6mg,0.01mmol),在室溫下攪拌14小時,加入2ml飽和亞硫酸鈉溶液終止反應,體系用稀硫酸調節至中性,乙酸乙酯萃取(10ml×3),飽和食鹽水洗滌,無水硫酸鈉干燥,減壓蒸去溶劑,殘渣柱層析純化(洗脫劑:環己烷∶乙酸乙酯=3∶2),得白色固體順式-(5R,6S)-5,6-雙羥基雷公藤內酯酮(29mg,0.07mmol,產率37%)。

    1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ4.91(m,2H),4.12(d,J=2.9Hz,1H),4.11(d,J=2.9Hz,1H),4.01(s,1H),3.15(s,1H),2.23(七重峰,J=6.9Hz,1H),2.09-2.17(m,1H),1.95-2.07(m,1H),1.85(dt,J=5.4,11.9Hz,1H),1.07(dd,J=4.6,12.1Hz,1H),0.88(s,3H),0.87(d,J=6.9Hz,3H),0.78(d,J=6.9Hz,3H);13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ197.7,173.1,160.4,125.6,72.6,71.0,65.7,65.0,64.6,64.0,61.4,58.6,56.0,25.6,24.8,18.0,16.8,16.0,15.7;IR(KBr)3431,2968,1740,1724,1672,1429,1136,1022cm-1;MS(EI,70eV)m/z390(M+,8),372(37),361(40),343(35),179(72),167(100),113(83);mp?266-268℃(分解)。

    實施例6??Δ5,6-脫氫雷公藤內酯醇和Δ5,6-脫氫表雷公藤內酯醇

    將Δ5,6-脫氫雷公藤內酯酮(36mg,0.1mmol)在3ml甲醇中的懸濁液冷卻至0℃,加入NaBH4(8mg,0.2mmo1),反應1小時,薄層層析(環己烷∶乙酸乙酯=1∶1)檢查原料完全消失,稀硫酸調節pH值至中性,減壓蒸干溶劑,殘渣用水10ml溶解,乙酸乙酯萃取(20ml×3),飽和食鹽水洗滌,無水硫酸鈉干燥,減壓蒸去溶劑,油狀物用柱層析分離(洗脫劑:環己烷∶乙酸乙酯=3∶1),得白色固體Δ5,6-脫氫雷公藤內酯醇(18mg,0.05mmol,產率50%)和Δ5,6-脫氫表雷公藤內酯醇(18mg,0.05mmol,產率50%)。

    Δ5,6-脫氫雷公藤內酯醇:

    1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ6.02(d,J=3.9Hz,1H),4.88(m,2H),3.88(d,J=3.3Hz,1H),3.58(d,J=11.0Hz,1H),3.52(d,J=3.3Hz,1H),3.45(d,J=3.9Hz,1H),2.87(d,J=11.0Hz,1H),2.43-2.48(m,1H),2.29-2.33(m.1H),2.25(七重峰,J=6.9Hz,1H),1.36-1.49(m,2H),1.34(s,3H),1.03(d,J=6.9Hz,3H),0.90(d,J=6.9Hz,3H);13C-NMR(CDCl3,100MHz)δ172.9,152.8,140.0,127.1,121.5,73.8,68.8,66.1,65.1,63.3,57.6,55.9,55.0,37.2,29.7,28.1,22.5,17.8,17.0,16.9;IR(KBr)3626,3473,2968,1776,1749,1655,1416,1040,1024cm-1;MS(EI,70eV)m/z358(M+,2),343(3),325(10)299(29),269(17),245(100),128(26);mp?194-196℃。

    Δ5,6-脫氫表雷公藤內酯醇:

    1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ6.07(d,J=4.2Hz,1Hz),4.90(m,2H),4.63(d,J=3.0Hz,1H),3.76(d,J=4.8Hz,1H),3.73(d,J=3.1Hz,1H),3.40(d,J=3.1Hz,1H),2.42-2.47(m,1H),2.37(七重峰,J=6.9Hz,1H),2.22-2.34(m,1H),1.93(d,J=3.0Hz,1H),1.34-1.49(m,2H),1.31(s,3H),1.11(d,J=6.9Hz,3H),0.83(d,J=6.9Hz,3H);13C-NMR(CDCl3,100MHz)δ173.0,153.1,140.6,127.0,122.0,68.9,66.2,65.7,64.8,64.4,56.7,53.2,51.6,37.4,29.9,27.4,22.6,19.0,17.1,15.8;IR(KBr)3435,2966,1778,1753,1429,1086cm-1;MS(EI,70eV)m/z358(M+,13),343(14),329(23),315(35),257(70),192(77),97(100);mp?172-174℃。

    實施例7??(5R,6S)-5,6-環氧雷公藤內酯醇和(5R,6S)-5,6-環氧表雷公藤內酯醇

    將(5R,6S)-5,6-環氧雷公藤內酯酮(36mg,0.1mmol)在3ml甲醇中的懸濁液冷卻至0℃,加入NaBH4(8mg,0.2mmol),反應1小時,薄層層析(環己烷∶乙酸乙酯=1∶1)檢查原料完全消失后用稀硫酸調節pH值至中性,減壓蒸干溶劑,殘渣用水10ml溶解,乙酸乙酯萃取(20ml×3),飽和食鹽水洗滌,無水硫酸鈉干燥,減壓蒸去溶劑,油狀物用柱層析分離(洗脫劑:環己烷∶乙酸乙酯=3∶1),得白色固體(5R,6S)-5,6-環氧雷公藤內酯醇(20mg,0.053mmol,產率56%)和(5R,6S)-5,6-環氧表雷公藤內酯醇(16mg,0.043mmol,產率43%)。

    (5R,6S)-5,6-環氧雷公藤內酯醇:

    1H-NMR(CDCl3,600MHz)δ4.62(m,2H),3.80(d,J=1.5Hz,1H),3.79(d,J=2.9Hz,1H),3.59(d,J=2.5Hz,1H),3.51(d,J=2.9Hz,1H),3.41(d,J=12.2Hz,1H),2.78(d,J=12.2Hz,1H),2.45-2.49(m,1H),2.28-2.33(m,1H),2.20(七重峰,J=6.9Hz,1H),1.58-1.63(m,1H),1.47-1.51(m,1H),1.31(s,3H),0.99(d,J=6.9Hz,3H),0.87(d,J=6.9Hz,3H);13C-NMR(CDCl3,100MHz)δ172.0,154.3,133.9,74.0,67.9,65.1,64.2,61.1,59.8,58.2,57.6,57.1,55.0,36.4,28.0,26.7,17.7,17.4,16.9;IR(KBr)3489,2928,1778,1431,1039cm-1;MS(EI,70eV)m/z374(M+,1),358(3),329(9),257(38),231(44),71(100);mp?248-250℃(分解)。

    (5R,6S)-5,6-環氧表雷公藤內酯醇:

    1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ4.66(m,2H),4.52(d,J=2.9Hz,1H),3.93(d,J=2.6Hz,1H),3.84(d,J=2.6Hz,1H),3.67(d,J=3.1Hz,1H),3.41(d,J=3.1Hz,1H),2.45-2.52(m,1H),2.35(七重峰,J=6.9Hz,1H),2.24-2.32(m,1H),1.80(d,J=2.9Hz,1H),1.61-1.67(m,1H),1.49-1.53(m,1H),1.28(s,3H),1.08(d,J=6.9Hz,3H),0.81(d,J=6.9Hz,3H);13C-NMR(CDCl3,100MHz)δ172.1,154.7,133.8,67.9,65.6,65.5,62.8,62.2,60.1,57.8,56.2,53.8,52.9,36.6,27.2,26.9,18.9,17.5,17.4,15.7;IR(KBr)3485,2928,1751,1435,1082,1040cm-1;MS(EI,70eV)m/z374(M+,1),358(4),345(10),327(11),257(40),231(98),71(100);mp?200-202℃(分解)。

    實施例8??順式-(5R,6S)-5,6-雙羥基雷公藤內酯醇和順式-(5R,6S)-5,6-雙羥基表雷公藤內酯醇

    將順式-(5R,6S)-5,6-雙羥基雷公藤內酯酮(39mg,0.1mmol)在3ml甲醇中的懸濁液冷卻至0℃,加入NaBH4(8mg,0.2mmol),反應1小時,薄層層析(環己烷∶乙酸乙酯=1∶1)檢查原料完全消失后用稀硫酸調節pH值至中性,減壓蒸干溶劑,殘渣用水10ml溶解,乙酸乙酯萃取(20ml×3),飽和食鹽水洗滌,無水硫酸鈉干燥,減壓蒸去溶劑,油狀物用柱層析分離(洗脫劑:環己烷∶乙酸乙酯=1∶1),得白色固體順式-(5R,6S)-5,6-雙羥基雷公藤內酯醇(10mg,0.026mmol,25%)和順式-(5R,6S)-5,6-雙羥基表雷公藤內酯醇(30mg,0.074mmol,75%)。

    順式-(5R,6S)-5,6-雙羥基雷公藤內酯醇:

    1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ4.90(m,2H),3.96(s,1H),3.75(d,J=2.9Hz,1H),3.52(d,J=2.9Hz,1H),3.39(s,1H),3.14(s,1H),2.16(七重峰,J=6.9Hz,1H),2.06-2.13(m,1H),1.92-2.06(m,1H),1.71-1.82(m,1H),1.01-1.08(m,1H),0.95(s,3H),0.89(d,J=6.9Hz,3H),0.75(d,J=6.9Hz,3H);13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ173.2,161.2,125.3,72.4,70.8,70.5,66.3,64.9,63.9,62.2,62.1,55.8,53.9,27.3,23.7,17.6,16.9,16.6,15.7;IR(KBr)3572,3494,3380,2926,1766,1427,1350,1041,1016cm-1;MS(EI,70eV)m/z392(M+,1),377(6),374(4),359(10),349(50),303(52),167(100),71(98);mp?232-234℃(分解)。

    順式-(5R,6S)-5,6-雙羥基表雷公藤表內酯醇:

    1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ4.89(m,2H),4.09(s,1H),3.96(s,1H),3.73(d,J=2.9Hz,1H),3.42(d,J=2.9Hz,1H),3.41(s,1H),2.19(七重峰,J=6.9Hz,1H),2.06-2.11(m,1H),1.93-2.03(m,1H),1.76-1.81(m,1H),0.99-1.03(m,1H),0.95(d,J=6.9Hz,3H),0.94(s,3H),0.68(d,J=6.9Hz,3H);13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ173.2,161.4,125.2,72.4,70.8,66.3,65.4,63.5,62.8,59.7,56.6,52.3,26.9,24.2,19.1,17.0,15.6;IR(KBr)3504,2962,1714,1444,1242,1053cm-1;MS(EI,70eV)m/z392(M+,1)374(2),349(13),303(14),257(11),179(44),91(95),71(100);mp?246-248℃(分解)。

    試驗例

    以下試驗例中,受試藥物由上海藥物研究所合成室提供,純度>99%。以母體化合物雷公藤內酯醇(LLDT-2)作為對照。

    試驗動物:Balb/c純系小鼠、ICR小鼠和昆明種小鼠,6-8周齡,購于中科院上海實驗動物中心,動物合格證書號:中科滬動管第99-003號。C57BL/6純系小鼠,6-8周齡,中科院上海藥物所清潔級動物房繁殖提供。除DTH模型采用雌性小鼠外,其余全為雄性小鼠。雄性SD大鼠,體重130-160g,中科院上海實驗動物中心提供。DBA/l小鼠從日本引進,由中科院上海藥物研究所SPF級動物房繁育提供。動物飼養于中科院上海藥物所清潔級動物房,12小時光/暗循環,24℃室溫,50-60%濕度。

    試劑:

    卡介苗購自衛生部上海生物制品研究所,批號200109001;牛II型膠原蛋白購自日本,批號40418N;山地明(環孢素注射液,50mg/ml)由瑞典Novartis制藥廠生產,批號143MFD0600;ELISA試劑盒為Pharmegen公司產品;刀豆蛋白A(Conannavalin?A,ConA)、細菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和DMSO為Sigma公司產品;金黃色葡萄球菌菌體Sac(Staphylococcus?aureusCowan?strain?1)為Biosciences公司產品;RPMI-1640培養液及小牛血清為GIBCOL公司產品;[3H]-胸腺嘧啶核苷為上海原子能研究所產品;其余試劑均為國產分析純。

    試驗例1??非特異性淋巴細胞毒性實驗

    實驗方法:

    (1)脫脊椎處死小鼠,無菌取其脾臟,磨碎制成單細胞懸液,去除紅細胞后,用含10%小牛血清的RPMI-1640培養液將細胞濃度調成5×106/ml。

    (2)于96孔板中加入90μl的細胞懸液,45μl的樣品,45μl含10%血清的培養液;對照加90μl此培養液,總體積為180μl。并設空白對照。

    (3)37℃,5%CO2培養箱中培養48小時。在結束培養前6-7小時,每孔加MTT?18μl。

    (4)結束培養時,每孔加溶解液90μl,在培養箱中放置6-7小時后,用酶標儀于570nM處測定OD值。

    實驗結果:

    雷公藤內酯醇(LLDT-2)的IC50為0.74ng/ml(R=0.991)*;根據LLDT-2的FW為360,換算成摩爾濃度LLDT-2的IC50約為2nM,(見圖1)。

    (5R)-5-羥基雷公藤內酯醇(LLDT-8)的IC50為78.2ng/ml(R=0.983);根據LLDT8的FW為376,換算為摩爾濃度LLDT-8的IC50約為208nM,(見圖2)。

    *計算軟件:GraphPAD?InPlot。采用非線性回歸法。

    試驗例2??抑制ConA或LPS誘導的淋巴細胞增殖反應

    實驗方法:

    (1)脫脊椎處死小鼠,無菌取其脾臟,磨碎制成單細胞懸液,去除紅細胞后,用含10%小牛血清的RPMI-1640培養液將細胞濃度調成5×106/ml。

    (2)于96孔板中加入100μl的細胞懸液,50μl的樣品,50μl?ConA或LPS,對照加50μl含10%血清的培養液??傮w積為200μl。

    (3)37℃,5%CO2培養箱中培養48小時。在結束培養前7-8小時,每孔加3H稀釋液25μl(即,1.9×1010Bq的[3H]-胸腺嘧啶核苷)。

    (4)在培養時間達到48小時,將ConA作用的培養板凍存于-20℃冰箱;再過12小時,將LPS作用的培養板凍存于-20℃冰箱。

    (5)用細胞收集儀(HARVESTER96,TOMTEC)收集細胞于玻璃纖維膜上,用液閃記數儀(MicroBeta?Trilux,PerkinElmer)檢測DNA對[3H]-胸腺嘧啶核苷的摻入量,反映細胞增殖情況。

    實驗結果:

    本發明的化合物對ConA誘導的小鼠T淋巴細胞增殖反應有明顯的抑制作用。例如,LLDT-8抑制ConA誘導的T淋巴細胞增殖反應的ED50為58.12ng/ml(R=0.998),其摩爾濃度的ED50為154.6nM(圖3),低于其IC50為200nM的淋巴細胞毒性;而LLDT-2抑制T淋巴細胞增殖反應的ED50為2.44ng/ml(R=0.998),其摩爾濃度的ED50為6.8nM(圖4),高于其IC50為2nM的淋巴細胞毒性,這表明LLDT-8抑制T淋巴細胞增殖反應的有效比活性明顯好于母體化合物LLDT-2。LLDT-8與臨床常用免疫抑制藥物環孢霉素(Cyclosporine,CsA)相比,其抑制活性比CsA的抑制活性弱5.4倍。CsA的ED50為34.62ng/ml(R=0.998),根據CsA的FW為1202.6,換算為摩爾濃度CsA的ED50約為28.8nM,(圖5)。

    本發明化合物對LPS誘導的小鼠B淋巴細胞增殖反應也有明顯的抑制作用。例如,LLDT-8抑制LPS誘導的B淋巴細胞增殖反應的ED50為59.80ng/ml(R=0.998),其摩爾濃度的ED50為159nM(見圖6),低于其IC50為200nM的淋巴細胞毒性;而LLDT-2抑制B淋巴細胞增殖反應的ED50為2.38ng/ml(R=1),其摩爾濃度的ED50為6.6nM(見圖7),高于其IC50為2nM的淋巴細胞毒性,這表明LLDT-8抑制B淋巴細胞增殖反應的有效比活性也明顯好于母體化合物LLDT-2。LLDT-8與CsA相比,其抑制活性比CsA的抑制活性強約4.3倍。CsA的ED50為816.7ng/ml(R=0.989),其摩爾濃度的ED50為679nM(見圖8)。

    以上的實驗研究結果也證實了現有技術的LLDT-2有非常強的非特異性細胞毒性作用,它雖然有強烈的免疫抑制活性,但其抑制活性依賴于細胞毒性作用,甚至有效半數使用量的ED50還要比其細胞毒性的IC50要高,所以顯然沒有實用價值。

    下表1是本發明的若干化合物非特異性淋巴細胞毒性和淋巴細胞增殖實驗結果匯總。

    ????????????表1??雷公藤二萜類內酯醇衍生物的免疫生物活性

    ????????????測定濃度??????細胞毒性??????T細胞增殖????B細胞增殖

    樣品

    ?????????????(M)???????????OD值??????????CPM值?????????CPM值

    對照???????????????????????0.337?????????125789????????87373

    ?????????????10-8?????????0.327?????????69613?????????77139

    LLDT-15??????10-7?????????0.316?????????63914?????????85240

    ?????????????10-6?????????0.156?????????10296?????????30889

    ?????????????10-8?????????0.372?????????89029?????????71877

    LLDT-16??????10-7?????????0.337?????????75599?????????82285

    ?????????????10-6?????????0.304?????????76204?????????80768

    ?????????????10-8?????????0.334?????????74069?????????73969

    LLDT-17??????10-7?????????0.355?????????67561?????????76376

    ?????????????10-6?????????0.310?????????84825?????????82861

    ?????????????10-8?????????0.367?????????92807?????????79808

    LLDT-18??????10-7?????????0.295?????????53513?????????75147

    ?????????????10-6?????????0.039?????????462???????????833

    ?????????????10-8?????????0.346?????????76183?????????69690

    LLDT-19??????10-7?????????0.340?????????71177?????????70587

    ?????????????10-6?????????0.340?????????79418?????????82989

    ?????????????10-8?????????0.374?????????69785?????????78259

    LLDT-20??????10-7?????????0.350?????????54771?????????85145

    ?????????????10-6?????????0.263?????????25344?????????63169

    ?????????????10-8?????????0.359?????????83465?????????76181

    LLDT-21??????10-7?????????0.332?????????73513?????????75766

    ?????????????10-6?????????0.361?????????97217?????????86610

    ?????????????10-8?????????0.374?????????64367?????????84748

    LLDT-22??????10-7?????????0.345?????????68787?????????89706

    ?????????????10-6?????????0.157?????????2662??????????16807

    ?????????????10-8?????????0.366?????????84713?????????76993

    LLDT-23??????10-7?????????0.349?????????104791????????86481

    ?????????????10-6?????????0.302?????????55614?????????99672

    試驗例3??抑制同種異體混合淋巴細胞增殖反應(MLR)

    實驗方法:

    (1)脫脊椎處死C57BL/6和Balb/c小鼠,無菌取其脾臟,磨碎制成單細胞懸液,去除紅細胞后,用含10%小牛血清的RPMI-1640培養液將細胞濃度調成6×106/ml。

    (2)C57BL/6脾細胞為反應細胞,Balb/c脾細胞(經鈷60照射,3000rads)為刺激細胞,兩種細胞等體積混合。

    (3)于96孔板中加入細胞混合液100μl,樣品100μl,對照加100μl含10%血清的培養液。并做兩種細胞的單獨培養對照。

    (4)37℃,5%CO2培養箱中培養3,4,5天。在結束培養前1天,加入3H稀釋液25μl(即,3.8×1010Bq的[3H]-胸腺嘧啶核苷)。

    (5)結束培養時,將培養板凍存于-20℃冰箱。

    (6)細胞收集儀(HARVESTER96,TOMTEC)收集細胞于玻璃纖維膜上,用液閃記數儀(MicroBeta?Trilux,PerkinElmer)檢測DNA對[3H]-胸腺嘧啶核苷的摻入量,反映細胞增殖情況。

    實驗結果:

    LLDT-8能抑制BALB/C抗C57BL/6的混合淋巴細胞增殖反應,其抑制活性約比CsA強2.5倍。

    LLDT-8的ED50為0.6ng/ml,其摩爾濃度的ED50為1.6nM(見圖9)。

    CsA的ED50為4.9ng/ml,其摩爾濃度的ED50為4.1nM(見圖10)。

    試驗例4??對淋巴細胞細胞因子產生的影響

    實驗方法:

    (1)脫脊椎處死小鼠,無菌取其脾臟,磨碎制成單細胞懸液,去除紅細胞后,用含10%小牛血清的RPMI-1640培養液將細胞濃度調成5×106/ml。

    (2)于24孔板中加入細胞懸液1ml,樣品及ConA(終濃度5μg/mL)或Sac(終濃度0.01%)各0.5ml,對照加0.5ml含10%小牛血清的培養液,終體積2mL。

    (3)37℃,5%CO2的培養箱中培養24或48小時后,收集培養上清,凍存于-20℃冰箱,細胞因子待測。

    (4)雙抗夾心酶聯免疫吸附實驗(ELISA法)檢測細胞因子的產生,以TMB作為酶反應底物,OD450nM檢測吸光度,根據標準曲線換算樣品細胞因子生成量。

    實驗結果:

    本發明的化合物對T淋巴細胞IFN-γ的產生有很強的抑制作用,對IL-2的產生也有抑制作用;并抑制巨噬細胞的細胞因子IL-12,TNF-α和IL-6的產生,但增強IL-10的產生。本發明的化合物明顯地支持Th2類型的細胞因子IL-10的產生,抑制Th1類型的細胞因子產生,對細胞介導免疫反應產生抑制效應。

    例如,LLDT-8在大大低于其淋巴細胞毒性IC50的濃度下,強烈抑制被SAC激活的小鼠脾淋巴細胞產生IFN-γ,甚至在0.0lnM的濃度時仍有抑制作用(見表2)。

    ??????????????表2??抑制SAC激活的淋巴細胞產生IFN-γ

    ??????????????????????????????Sac激活的淋巴細胞產生IFN-γ

    LLDT-8濃度(nM)

    ??????????????????????????平均值(pg/ml)??????????????????SD

    ?????-???????????????????????1302.6?????????????????????18.18

    ?????100?????????????????????227.4??????????????????????14.91

    ?????10??????????????????????465.3??????????????????????10.74

    ?????1???????????????????????810.3??????????????????????57.03

    ?????0.1?????????????????????850.5??????????????????????0

    ?????0.01????????????????????809.7??????????????????????28.50

    LLDT-8還抑制ConA誘導的淋巴細胞IL-2的產生(見表3)。

    ????????????????????表3??抑制ConA誘導的淋巴細胞IL-2的產生

    ????????????????????????????????Con誘導的淋巴細胞IL-2的產生

    LLDT-8濃度(nM)

    ?????????????????????????????平均值(Pg/ml)???????????????????SD

    ?????-?????????????????????????3724.4???????????????????????139.2

    ?????30????????????????????????2872.7???????????????????????24.7

    ?????3?????????????????????????3494.2???????????????????????16.5

    ?????0.3???????????????????????3857.2???????????????????????172.5

    LLDT-8還抑制SAC激活的淋巴細胞產生細胞因子IL-12,TNF-α和IL-6的產生,增強IL-10(表4)。????

    ???????????表4??對SAC激活的淋巴細胞細胞因子產生的影響

    LLDT-8濃度?????????????????????Sac激活的淋巴細胞淋巴因子的產生

    ???(nM)?????????????????IL-10??????IL-12??????TNF-α??????????????IL-6

    ????-???????????????????2306????????980????????4062???????1528

    ????30??????????????????3262????????602????????3649???????989

    ????3???????????????????2816????????939????????3899???????1403

    ????0.3?????????????????2866????????917????????4686???????1585

    試驗例5??誘導T淋巴細胞凋亡

    實驗方法:

    (1)培養液孵育Tuf-Tainer(對細胞無粘附性)2小時;

    (2)同增殖實驗,取Balb/c小鼠脾臟細胞,制成單細胞懸液,調成5×106/ml;

    (3)加入所需的細胞數和5mg/ml?ConA或培養液;

    (4)37℃,5%CO2培養箱中培養一定時間(24-96小時);

    (5)反應結束后,PBS洗細胞,離心,4℃,400g×10min;

    (6)劇烈震蕩10秒,緩慢加入1ml冰冷70%乙醇,蓋上蓋子,4℃冰箱固定過夜;

    (7)離心3000rpm×5min,棄乙醇,加入1ml?PI染液,室溫放置>30min;

    (8)24小時內上FACs檢測。

    實驗結果:

    現有的實驗結果顯示本發明化合物在低于或接近細胞毒性IC50濃度時具有誘導小鼠T淋巴細胞發生凋亡的作用,并能降低CD4+和CD8+T淋巴細胞比例,這可能是其發揮抗炎免疫抑制作用的機制之一。

    試驗例6??抑制DNFB誘導的小鼠遲發性超敏反應(DTH)

    實驗方法:

    (1)Balb/c小鼠(雌性,6-8周齡),每只后腳以20μl?0.5%DNFB致敏,次日加強(DNFB溶于[丙酮∶橄欖油=4∶1]油劑中);

    (2)第7-9天,鼠左耳內外兩側各10μl?0.4%DNFB進行攻擊;

    (3)攻擊前1小時腹腔注射或灌胃一次,12小時后再給藥一次;

    (4)攻擊后24-48小時,檢測各指標。

    注:ICR小鼠(雌性,6-8周齡),致敏劑濃度為0.7%,攻擊劑濃度為0.6%。

    實驗結果:

    在經典的DNFB誘導的小鼠遲發性超敏反應(DTH)模型上,檢測了本發明化合物是否對細胞介導免疫反應具有免疫抑制活性作用。結果證明,經由腹腔注射和口服灌胃兩個給藥途徑,LLDT-8對DTH反應具有非常強烈的抑制作用。

    1.腹腔注射LLDT-8抑制DTH反應:

    LLDT-8腹腔給藥量1mg/kg,每日一次,共5次,明顯抑制DNFB誘導的小鼠遲發性超敏反應,對細胞介導的免疫反應DTH的抑制活性與環孢霉素10mg/kg用藥量比,LLDT-8的抑制作用明顯地強于環孢霉素的作用。LLDT-81mg/kg/d實驗組對淋巴器官(脾臟)及體重沒有明顯影響(見表5)。

    ???????表5??對DNFB誘導的小鼠遲發性超敏反應的抑制作用

    ??????????????????????(腹腔注射給藥)

    ????????劑量?????????????????????耳重差??????給藥前/后???????脾重

    實驗組????????左耳重????右耳重

    ??????(mg/kg)?????????????????????(mg)????????體重(g)????????(mg)

    對照組???-?????63.8??????31.2?????32.6????????20/20?????????142.4

    CsA??????10????59.0??????32.3?????26.7????????21/20?????????152.3

    LLDT-8???1?????56.9??????35.5?????21.4????????21/21?????????140.3

    ·BALB/C小鼠,n=11-12。

    降低LLDT-8的使用劑量和次數,1mg/kg,0.2mg/kg,0.04mg/kg,每日一次,共2次,LLDT-8對DTH的抑制活性與環孢霉素10mg/kg同樣有很強的免疫抑制效應(見表6)。

    ??????表6??對DNFB誘導的小鼠遲發性超敏反應的抑制作用

    ??????????????????????(腹腔注射給藥)

    ??????????劑量?????????????????????????????????????耳重差

    實驗組??????????????????左耳重?????????右耳重

    ?????????(mg/kg)????????????????????????????????????(mg)

    對照組?????-?????????????61.1???????????30.0????????31.1

    CsA????????10????????????55.6???????????32.5????????23.1

    LLDT-8?????1?????????????56.4???????????33.0????????23.4

    LLDT-8?????0.2???????????55.3???????????37.4????????17.9

    LLDT-8?????0.04??????????55.5???????????29.4????????26.1

    ·ICR小鼠,n=5。

    降低LLDT-8的使用劑量到2μg/kg時,仍有顯著的抑制DTH反應的效應,似乎低劑量時LLDT-8呈現出更強烈的免疫抑制效應(見表7)。

    ???????表7??對DNFB誘導的小鼠遲發性超敏反應的抑制作用

    ???????????????????(低濃度腹腔注射給藥)

    ???????????劑量????????????????????????????????耳重差

    實驗組???????????????左耳重???????右耳重

    ?????????(μg/kg)??????????????????????????? X±SD(mg)

    對照組?????-??????????49.6?????????26.3??????23.3±4.3

    LLDT-8?????200????????44.3?????????27.2??????17.1±5.1*

    LLDT-8?????40?????????42.6?????????25.7??????16.9±2.7**

    LLDT-8?????8??????????46.3?????????29.7??????16.6±4.1**

    LLDT-8?????2??????????44.3?????????27.5??????16.8±5.4**

    ·與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;

    ·BALB/c小鼠,n=12。

    超低濃度的LLDT-8在0.4μg/kg使用劑量時,仍有顯著的抑制DTH反應的效應,并與CTX在1mg/kg和LLDT-2在40μg/kg時的抑制效應相近(見表8)。

    ?????????表8??對DNFB誘導的小鼠遲發性超敏反應的抑制作用

    ?????????????????????(超低濃度腹腔注射給藥)

    ????????劑量???????????????????????耳重差??????給藥前/后????脾重

    實驗組??????????左耳重???右耳重

    ??????(μg/kg)??????????????????? X±SD(mg)????體重(g)?????(mg)

    對照組???-???????49.1?????26.4????22.7±2.1????22.4/21.9????154.0

    CTX??????1000????45.9?????30.3????15.6±8.1*??22.1/21.1????141.2

    LLDT-2???40??????47.9?????30.2????17.7±5.7????21.5/21.2????151.4

    LLDT-8???40??????46.7?????29.6????17.1±4.9**?21.6/21.4????168.5

    LLDT-8???4???????42.1?????26.8????15.3±4.6**?21.4/21.8????163.3

    LLDT-8???0.4?????47.0?????29.2????17.7±4.7*??22.3/22.6????164.2

    ·與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;

    ·BALB/c小鼠,n=10。

    2.口服給藥LLDT-8抑制DTH反應:

    在對DNFB誘導的小鼠DTH反應中,口服給藥LLDT8,1mg/kg,每日一次,共2次就能顯著地抑制DTH這一細胞介導的免疫反應(見表9)。

    ????????表9??對DNFB誘導的小鼠遲發性超敏反應的抑制作用

    ???????????????????????(口服給藥)

    ????????劑量?????????????????????耳重差?????給藥前/后????脾重

    實驗組?????????左耳重???右耳重

    ???????(mg/kg)????????????????????(mg)???????體重(g)?????(mg)

    對照組???-??????49.3?????25.9?????23.4????????20/19??????125.8

    CsA??????10?????33.4?????25.7?????7.7?????????20/18??????123.0

    LLDT-2???0.2????41.2?????24.5?????16.7????????21/20??????127.0

    LLDT-8???1??????40.4?????27.3?????13.1????????21/21??????124.4

    ·BALB/c小鼠,n=5-6。

    低濃度的LLDT-8在口服給藥時,仍有顯著的抑制效應。40μg/kg的LLDT-8與4mg/kg的CsA在口服給藥時的免疫抑制活性強度相當(見表10)。

    ???????表10??對DNFB誘導的小鼠遲發性超敏反應的抑制作用

    ???????????????????(口服給藥)

    ??????????劑量???????????????????????????????耳重差

    實驗組??????????????左耳重???????右耳重

    ?????????(mg/kg)?????????????????????????????(mg)

    對照組?????-?????????75.2?????????33.7???????41.5

    CsA????????4?????????72.5?????????39.8???????32.7

    LLDT-8?????1?????????63.5?????????39.4???????24.1

    LLDT-8?????0.2???????68.2?????????38.2???????30.0

    LLDT-8?????0.04??????69.0?????????35.2???????33.8

    ·ICR小鼠,n=5-6。

    試驗例7??抑制小鼠B細胞抗羊紅細胞特異性抗體的產生

    實驗方法:

    (1)新鮮羊紅血細胞(SRBC)經pH7.2?PBS洗3次,1∶20稀釋;

    (2)新鮮豚鼠血清1∶10稀釋;

    (3)配制2×107/ml小鼠脾臟細胞懸液;

    (4)三者分別取1ml混合,37℃,1.5小時;2500rpm×15分鐘離心,取上清,520nM測OD值。

    小鼠在給藥后第三天致敏:將羊紅細胞用生理鹽水洗滌三次,按5%比例稀釋SRBC壓積,每只小鼠腹腔注射0.2ml,于致敏后第六天解剖取脾臟細胞測定其抗體生成量。

    實驗結果:

    本發明化合物不僅對細胞介導的免疫反應有抑制作用,而且對體液免疫反應也有抑制作用。在羊紅細胞誘導的小鼠B細胞抗羊紅細胞特異性抗體生成的實驗中,LLDT-8明顯地抑制B細胞抗羊紅細胞特異性抗體的生成,在腹腔給藥40μg/kg的低劑量時,仍有顯著的抑制效應;CsA主要是抑制T細胞的功能,對B細胞抗羊紅細胞特異性抗體的生成沒有抑制效應;LLDT-8和CsA一樣有降低血清總IgG抗體的濃度;LLDT-8腹腔給藥明顯地升高血清補體C3的濃度,表示機體提高了對免疫復合體的清除能力,LLDT-8和CsA一樣具有免疫抑制劑常有的這一特征(見表11)。

    ??????表11??對小鼠B細胞抗羊紅細胞特異性抗體產生的抑制作用

    ?????????????????????(腹腔注射給藥)

    ????????劑量?????QHS??????血清IgG???????血清C3????體重?????脾重???胸腺重

    實驗組

    ???????(mg/kg)???OD值???(μg/10μl)??(μg/10μl)??(g)????(mg/10g)??(mg)

    對照組???-???????0.208?????185.5????????16.8??????23.5?????66.4????39.6

    CsA??????4???????0.247?????173.9????????19.1??????22.9?????65.6????31.8

    LLDT-8???1???????0.158?????182.9????????19.4??????22.3?????59.6????36.6

    LLDT-8???0.2?????0.162?????165.9????????19.7??????23.1?????76.3????36.9

    LLDT-8???0.04????0.175?????176.6????????19.5??????23.0?????74.8????32.1

    ·ICR小鼠,雌性,6-8周齡,每組動物數8只,腹腔注射給藥,共4次;

    ·QHS為PFC的改良檢測法。

    LLDT-8在口服給藥40μg/kg的低劑量時,也同樣對B細胞抗羊紅細胞特異性抗體的生成有顯著的抑制效應,但對血清抗體總LgG和血清補體C3的濃度沒有明顯的影響作用(見表12)。

    ?????????表12??對小鼠B細胞抗羊紅細胞特異性抗體產生的抑制作用

    ???????????????????????????(口服給藥)

    ????????劑量?????QHS????血清IgG???????血清C3????體重?????脾重????胸腺重

    實驗組

    ???????(mg/kg)???OD值??(μg/10μl)?(μg/10μl)??(g)????(mg/10g)???(mg)

    對照組????-??????0.38?????117??????????7.9??????23.4?????55.7?????28.8

    CTX???????4??????0.12?????101??????????7.5??????22.6?????50.7?????28.2

    LLDT-8????1??????0.24?????118??????????6.8??????23.0?????63.7?????32.5

    LLDT-8????0.2????0.34?????116??????????7.9??????24.0?????61.6?????36.6

    LLDT-8????0.04???0.23?????123??????????6.7??????23.0?????69.0?????28.7

    ·ICR小鼠,雌性,6-8周齡,每組動物數8只,口服給藥,共4次,但陽性對照藥CTX為腹腔給藥。

    試驗例8??對佐劑性大鼠關節炎的防治作用

    1.佐劑性大鼠關節炎動物模型的誘發及防治

    雄性SD大鼠60只,隨機分成5組,將滅活的BCG用滅菌的液體石蠟配成10g/L,震蕩混勻,皮內注射0.1ml于大鼠左后足墊內。注射后連續觀察28天,以注射對側繼發性足腫脹為關節炎發生的指征。從第12天起每隔四天用排水法測踝關節以下足體積。同時,對多發性關節炎病變的嚴重程度按以下標準進行評分:0:無紅腫;1:小趾關節稍腫;2:趾關節和足跖腫脹;3:踝關節以下的足爪腫脹;4:包括踝關節在內全部足爪腫脹。每只大鼠的最大得分為16。

    在佐劑誘導關節炎的前兩天開始腹腔注射給藥,LLDT-8用量為3mg/kg/天、1mg/kg/天、0.2mg/kg/d和CsA?10mg/kg/天,一直持續至免疫后第28天。從第12天開始每天對大鼠多發性關節炎進行評分,并且每隔4天對繼發性關節炎的病癥情況進行評估,右足繼發性關節炎和對四肢踝關節以下足體積進行測定。

    淋巴細胞增殖實驗:大鼠免疫第28天,處死后無菌取其脾臟,磨碎制成單細胞懸液,去除紅細胞后,用含10%小牛血清的RPMI-1640培養液將細胞濃度調成5×106/ml。于96孔板中加入100μl的細胞懸液,100μl?ConA或LPS,對照加100μl含10%血清的培養液,總體積為200μl。37℃?,5%CO2培養箱中培養48小時。在結束培養前7-8小時,每孔加3H稀釋液25μl(即,1.9×1010Bq的[3H]-胸腺嘧啶核苷)。在培養時間達到48小時后,用細胞收集儀(HARVESTER96,TOMTEC)收集細胞于玻璃纖維膜上,用液閃記數儀(MicroBeta?Trilux,PerkinElmer)檢測DNA對[3H]-胸腺嘧啶核苷的摻入量,反映細胞增殖情況。

    脾臟淋巴細胞因子誘導:大鼠免疫第28天,乙醚麻醉處死,無菌取其脾臟,磨碎制成單細胞懸液,去除紅細胞后,用含10%小牛血清的RPMI-1640培養液將細胞濃度調成5×106/ml。于24孔板中加入細胞懸液1ml,樣品及ConA(終濃度5μg/mL)1ml,對照加1ml含10%血清的培養液,終體積2mL。37℃,5%CO2培養箱中培養24或48小時后,收集培養上清,凍存于-20℃冰箱,細胞因子待測。

    大鼠腹腔巨噬細胞的獲取及細胞因子誘導:大鼠免疫第28天,乙醚麻醉處死,無菌取其腹腔巨噬細胞,洗去非粘附細胞后,加入含LPS(終濃度5μg/mL)的RPMI1640培養液1ml,對照加1ml含10%血清的培養液。37℃,5%CO2培養箱中培養6,24或48小時后,收集培養上清,凍存于-20℃冰箱,細胞因子待測。

    實驗結果表明:LLDT-8對大鼠佐劑性關節炎的右足繼發性關節炎腫脹有非常明顯的防治作用。用量為3mg/kg/d,1mg/kg/d,0.2mg/kg/d的LLDT-8防治組和10mg/kg/d的CsA對照組均可明顯抑制佐劑性關節炎引起的大鼠繼發性足腫脹,各劑量組的LLDT-8防治組的防治效果與10mg/kg/d的CsA對照組相等(見圖11)和(見圖12)。

    病理學診斷的檢查也證實了各劑量組的LLDT-8防治組和CsA對照組都有顯著的抑制炎性細胞對關節組織的浸潤,保護關節腔滑膜完整,防止關節腔的粘連和骨質破壞。

    LLDT-8對大鼠佐劑性關節炎四肢多發性病變的防治作用評估表明,3mg/kg/d,1mg/kg/d,0.2mg/kg/d的LLDT-8防治組和10mg/kg/d的CsA對照組均可明顯改善大鼠多發性關節炎病變癥狀。1mg/kg/d,0.2mg/kg/d的LLDT-8防治組對佐劑誘導的原發性(左)足爪腫脹的防治作用較弱故影響了評定的總指數,但3mg/kg/d的LLDT-8防治組對原發性左足爪腫脹有非常明顯的抑制作用,防治效果與10mg/kg/d的CsA對照組相等(見圖13)。

    LLDT-8在長達30天對大鼠佐劑性關節炎的治療中有防止體重減輕的作用,從第12天起未治療模型組的大鼠體重開始明顯下降,3mg/kg/d,1mg/kg/d,0.2mg/kg/d的LLDT-8防治組和10mg/kg/d的CsA對照組均可明顯改善關節炎導致的大鼠體重減輕(見圖14)。

    LLDT-8抑制LPS誘導的大鼠B淋巴細胞增殖反應,3mg/kg/d,1mg/kg/d,0.2mg/kg/d的LLDT-8防治組和10mg/kg/d的CsA對照組的大鼠B淋巴細胞對LPS誘導的增殖反應性明顯降低(見圖15)。

    2.對大鼠佐劑性關節炎的治療作用:

    滅活的BCG用滅菌的液體石蠟配成10g/L,震蕩混勻,皮內注射0.1ml于大鼠左后足墊內。注射后直至關節炎完全形成。注射佐劑一側足跖從第一天起持續腫脹4天,而后消腫,于第八天起再次持續腫脹,第十六天達最高。繼發性反應于12天發生,主要表現為注射佐劑對側足跖腫脹,尾部、耳部、及前肢關節也有不同程度的腫脹。對多發性關節炎病變的嚴重程度按以下標準進行評分:0:無紅腫;1:小趾關節稍腫;2:趾關節和足跖腫脹;3:踝關節以下的足爪腫脹;4:包括踝關節在內全部足爪腫脹。

    動物分級及給藥:注射佐劑后第19天,關節炎大鼠繼發病變反應趨于穩定,全身病變也較明顯。將上述大鼠隨機分成6組,每組8只,即,佐劑(AA)對照組(8只),LLDT-8?2mg/kg(8只),LLDT-8?1mg/kg(8只),LLDT-8?0.5mg/kg(8只),LLDT-8?0.25mg/kg(8只),CsA?10mg/kg(8只)。連續給藥14天,每隔3天測量右足體積并根據病變情況評分。給藥后第15天處死大鼠,解剖取胸腺和脾臟稱重,測定臟器指標。

    實驗結果:

    LLDT-8對大鼠佐劑性關節炎的繼發性足腫脹有一定的治療作用。注射佐劑后19天,右後足跖腫脹顯著,繼發病變形成。LLDT-8在較高濃度2mg/kg/d時,給藥6天后可見腫脹稍有消退,12天后足跖腫脹顯著消退,與模型對照組比較有非常顯著性的差異,并與CsA?10mg/kg/d治療組作用相近(見圖16)。

    LLDT-8對大鼠佐劑性關節炎四肢多發性關節炎的治療作用評估顯示2mg/kg/d,1mg/kg/d的LLDT-8治療組均明顯改善大鼠多發性關節炎病變癥狀,比10mg/kg/d的CsA對照組的療效弱(見圖17)。

    試驗例9??對牛II型膠原誘導的小鼠關節炎的治療作用

    實驗方法:

    1.DBA/1小鼠關節炎的誘導及癥狀評定

    牛II型膠原于實驗前一天溶解于0.1M醋酸中,實驗當天將含Mycobacterium?tuberculosis?strain?H37Rv的CFA與膠原充分乳化后,以125mg乳化劑于DBA/1小鼠尾基部進行致敏,3周后以相同劑量的乳化劑于尾部進行攻擊。在攻擊前一天開始進行連續2周的腹腔給藥治療。關節病變的嚴重程度通過評分決定,每一肢體關節炎評分指數在0到6分之間,結果以四肢評分總和的平均值形式表示。

    2.細胞增殖及細胞因子的產生

    a.無菌制備外周淋巴結或脾臟單個細胞懸液。

    b.于96孔板中,每孔加入100μl?5×106/ml細胞,并同時加入100μl膠原或培養液作為刺激劑,37℃,5%CO2培養箱中培養3,4,5天。在結束培養前24小時,每孔加[3H]-胸腺嘧啶核苷稀釋液25μl(即1.9×1010Bq)。

    c.培養結束后,將96孔板凍存于-20℃冰箱。

    d.用細胞收集儀(HARVESTER96,TOMTEC)收集細胞于玻璃纖維膜上,用液閃記數儀(MicroBeta?Trilux,PerkinElmer)檢測DNA對[3H]-胸腺嘧啶核苷的摻入量,反映細胞增殖情況。

    3.抗膠原抗體的免疫測定(ELISA方法)

    a.包被平板:50mg/ml膠原每孔50μl包被96孔酶標板,于37℃作用1小時。結束后用PBS洗3次;

    b.加標準品及樣品:每孔50μl,室溫反應1小時。結束后用PBS洗3次;

    c.加酶:家兔抗小鼠-IgG(H+L)coupled?to?HRP(1∶2000)每孔50μl,室溫反應30分鐘。結束后用PBS洗3次;

    d.加底物顯色:檸檬酸+TMB+H2O2,每孔100μl,室溫反應15分鐘;

    e.終止:1M?H2SO4,每孔50ul;測OD值:于酶標儀上以雙波長450nM和570nM測定OD值。

    g.計算:根據所設標準品,計算血清中抗膠原特異性抗體的生成量。

    實驗結果:

    牛II型膠原誘導DBA/1小鼠關節炎模型的發病情況與人類風濕性關節炎相似,1mg/kg/d的LLDT-8腹腔注射給藥與模型對照組相比,LLDT-8非常顯著地抑制關節炎的發生,顯示了良好的防治效果(見圖18)和(見圖19)。

    在0.2mg/kg/d和0.04mg/kg/d較低濃度的LLDT-8腹腔注射給藥時,與模型對照組相比,呈劑量依賴性地抑制或緩解關節炎病變的發生,顯示了有效的治療作用(見圖20)。

    檢測經LLDT-8治療后的關節炎小鼠血清中抗牛II型膠原特異性抗體的生成情況,研究發現LLDT-8治療各組血清中抗牛II型膠原特異性抗體的產生與模型對照組相比,呈劑量依賴性的抑制關節炎小鼠血清中特異性抗體的產生。這表明了LLDT-8對體液免疫反應有很好的抑制作用(見圖21)。

    試驗例10??在小鼠同種異體皮膚移植中的作用

    實驗方法:

    1.無菌環境中處死C57?BL/6小鼠,于尾部腹面縱向切開,取下尾巴,剝皮,平鋪置于培養皿中PBS濕潤的濾紙上,切成所需大小皮片;

    2.鹽酸氯氨酮麻醉Balb/c小鼠,在背側部去除一片毛發,形成所需手術野;

    3.于于術板上固定Balb/c小鼠,在背側部去除手術野的一塊皮膚,構成移植床,比將要移植的皮片稍大;

    4.將合適大小的C57BL/6皮片貼于移植床上,凡士林紗布貼附,并用綁帶包扎緊;

    5.皮膚移植前一天開始每天腹腔給藥處理;

    6.?1周后,去除綁帶,觀察皮膚移植排斥情況,當所有小鼠發生皮膚移植排斥時停止給藥;

    7.移植皮片以發生完全損傷干燥為發生排斥標準。

    實驗結果:

    初步的小鼠同種異體皮膚移植(C57B6?skin?to?BALB/c)實驗結果提示了本發明化合物可延緩BALB/c小鼠對同種異體C57B6小鼠皮膚移植的排斥反應,這顯示了本發明化合物可能還有希望應用于臨床預防器官移植的排斥反應。

    試驗例11??抗腫瘤生物活性

    進行常規的抗腫瘤生物活性體外篩選試驗,結果表明,本發明化合物對人的腫瘤細胞株:p-388小鼠白血病*,HL-60人白血病*,A-549人肺腺癌,MKN-28人胃癌,SGC-7901人胃癌,MCF-7人乳腺癌,BEL-7402人肝癌,HO-8910人卵巢癌,WI-38人纖維細胞等有較強的抗腫瘤活性作用(見表13)。

    ???????????表13??對人源腫瘤細胞生長的抑制作用(IC50/μM)

    濃度????(μM)???????????????????????IC50/μM

    細胞株??P-388??HL-60??A-549??MKN-28??SGC-7901??MCF-7??BEL-7402??HO-8910??WI-38

    LLDT-8??0.080??0.081??0.032??0.39????0.043?????0.35???0.085?????0.22?????0.48

    細胞株:P-388小鼠白血病,HL-60人白血病,A-549人肺腺癌,MKN-28人胃癌,SGC-7901人胃癌,MCF-7人乳腺癌,BEL-7402人肝癌,HO-8910人卵巢癌,WI-38人纖維細胞。

    試驗例12??小鼠急性毒性試驗

    小鼠腹腔注射LLDT-8急性毒性試驗

    小鼠一次腹腔注射LLDT-8,觀察即刻反應,并連續觀察14天,記錄死亡情況。給藥當天未見死亡。死亡出現在給藥后第二天,解剖時可見心臟淤血。小鼠死亡主要發生在給藥后2-5天,死亡高峰集中在第2-4天。雌雄小鼠死亡率無明顯差異。存活小鼠第15天全部解剖,肉眼檢查各臟器未見明顯病變。

    用Bliss法求得LD50為:9.3mg/kg;95%可信限為:7.7~11.3mg/kg。

    與此相比,LLDT-2的急性毒性試驗的LD50為:0.5mg/kg左右。因此,LLDT-8的毒性大大低于其母體化合物LLDT-2,從而提高了可安全使用的劑量范圍。

    小鼠口服灌胃LLDT-8急性毒性試驗

    小鼠一次口服灌胃LLDT-8,觀察即刻反應,并連續觀察14天,記錄死亡情況。給藥當天未見死亡。死亡出現在給藥后第二天,解剖時可見胃幽門、十二指腸及空腸和回腸均有明顯出血。小鼠死亡主要發生在給藥后2-5天,死亡高峰集中在第2-3天。雌雄小鼠死亡率無明顯差異。存活小鼠第15天全部解剖,肉眼檢查各臟器未見明顯病變。

    用Bliss法求得LD50為:6.8mg/kg;95%可信限為:5.4~8.4mg/kg。

    以上的實施例和試驗例僅僅是舉例說明本發明提供的化合物的結構及其合成方法和藥理實驗結果,但對本領域的技術人員來說可以對此作出種種修改和變化,而不背離本發明的精神和范圍,所附的權利要求書覆蓋本發明范圍內的所有這些修改。

    產業上利用的可能性

    本發明以雷公藤內酯醇為起始物,提供了新型的雷公藤二萜類內酯衍生物及相關的合成方法。

    本發明的雷公藤二萜類內酯衍生物,特別是(5R)-5-羥基雷公藤內酯醇(LLDT-8),在多種體外實驗系統和體內實驗動物模型的研究中證實具有廣泛的抗炎免疫抑制活性,而且在體內實驗中口服和腹腔給藥都有非常顯著的免疫抑制活性,表現為高效低毒,具有很好的安全治療指數。

    本發明的雷公藤二萜類內酯衍生物,特別是(5R)-5-羥基雷公藤內酯醇(LLDT-8),以及它們的組合物可作為抗炎免疫抑制劑,用于預防和治療自身免疫性疾病(類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、慢性腎炎、糖尿病等)、感染性疾病(艾滋病和病毒性肝炎等)、嚴重過敏性疾病、各種皮膚疾病、心血管系統疾病和器官移植后的排異反應,以及用于抗生育等與機體免疫系統的功能及反應狀態異常有關的疾病。

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雷公藤 內酯 衍生物 及其 應用
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