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一種腫瘤浸潤淋巴細胞的分離方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201510124216.3

申請日:

2015.03.20

公開號:

CN104762261A

公開日:

2015.07.08

當前法律狀態:

實審

有效性:

審中

法律詳情:

實質審查的生效IPC(主分類):C12N 5/0783申請日:20150320|||公開

IPC分類號:

C12N5/0783(2010.01)I

主分類號:

C12N5/0783

申請人:

浙江大學

發明人:

吳健; 曹林平; 陳康杰; 丁超峰

地址:

310058浙江省杭州市西湖區余杭塘路866號

優先權:

專利代理機構:

杭州中成專利事務所有限公司33212

代理人:

周世駿

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內容摘要

本發明涉及細胞分離技術,旨在提供一種腫瘤浸潤淋巴細胞的分離方法。該方法是將腫瘤組織塊加入至胰酶消化液浸泡、孵育,使腫瘤組織塊充分消化打散;分離、收集單個細胞經胰酶消化液重懸后進行多次密度梯度離心,再以紅細胞裂解液孵育、離心,用含小牛血清的PBS緩沖液重懸;得到溶解的腫瘤浸潤淋巴細胞。在本發明中,酶消化結合機械法雙重高效分離腫瘤浸潤淋巴細胞,與機械法或酶消化法相比,本發明獲得腫瘤浸潤淋巴細胞存活率高且簡便易行。該方法分離所得的腫瘤浸潤淋巴細胞在體外經白細胞介素2(IL-2)刺激后可大量增殖,具有特異高效的抗腫瘤活性,為臨床治療腫瘤提供強有力的依據和新的途徑。

權利要求書

1.  一種腫瘤浸潤淋巴細胞的分離方法,其特征在于,包括如下步驟:
(1)以PBS緩沖液洗滌腫瘤組織塊后,置于培養皿中,加入5~10體積倍的胰酶消化液浸泡3小時;
(2)將浸泡處理后的腫瘤組織塊修剪成0.5mm3的顆粒狀后,置培養皿在37℃水浴搖床中,將腫瘤組織與胰酶消化液一并孵育1~2小時,使腫瘤組織塊充分消化打散;收集細胞懸液并過200目金屬濾網,分離收集單個細胞至50ml離心管中;用胰酶消化液洗滌培養皿2次,將所有液體轉移至該50ml離心管中;
(3)將前一步驟的50ml離心管放在冰上靜置10分鐘后,在50g離心機上離心處理2分鐘;棄底部沉淀,轉移上清液至另一50ml離心管中,在400g離心機上離心處理5分鐘,棄上清,加入3ml胰酶消化液重懸;
(4)向前一步驟經重懸的離心管中加入密度梯度離心液,進行密度梯度離心;然后收集云霧層細胞,轉移至另一玻璃管中,加入3ml胰酶消化液重懸;
加入的密度梯度離心液與細胞懸液的質量比為1:1~2,密度梯度離心過程中控制條件為500g×20分鐘,加速9減速4,溫度10℃;
(5)向前一步驟經重懸的離心管中加入1×紅細胞裂解液2ml,孵育5分鐘后加入2ml PBS緩沖液終止孵育;在400g離心機上離心5分鐘,棄上清;以PBS緩沖液洗滌細胞2次后,用含10wt%小牛血清的PBS緩沖液重懸;該離心管中溶解的細胞即為腫瘤浸潤淋巴細胞;
所述胰酶消化液是以Hanks'平衡液為溶劑,溶液中包括0.05wt%的collagenase type IV和0.001wt%的DNase I,每200ml Hanks'平衡液加入O.111g CaCl2。

說明書

一種腫瘤浸潤淋巴細胞的分離方法
技術領域
本發明屬于細胞分離技術,涉及一種腫瘤浸潤淋巴細胞的分離方法。
背景技術
1986年Rosenberg等人首先報道了從小鼠實體瘤中分離到的淋巴細胞,稱之為“腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)”,是主要存在于腫瘤間質內的T細胞為主的一個異質性淋巴細胞群體,大多聚集在腫瘤周圍或其間質呈套狀圍繞癌巢。進一步研究發現,這種細胞在體外經白細胞介素2(IL-2)刺激后可大量增殖,且具有較強的特異性殺傷腫瘤細胞的作用,其抗腫瘤作用比淋巴因子激活的殺傷細胞(Lymphokine activated killer cell,LAK)高50-100倍。例如有研究發現,黑色素瘤患者的TIL只對自體瘤細胞產生殺傷活性,而對自身細胞正常。
TIL細胞表型具有異質性。一般來說,新鮮制備的原位TIL中絕大多數為T細胞。不同腫瘤來源的TIL細胞中,CD4+T細胞和CD8+T細胞的比例有顯著差異。除黑色素瘤、頭頸部腫瘤外,其他腫瘤中以CD8+T細胞為主。新鮮分離的TIL中CD25+細胞百分率較低,隨著體外加IL-2培養時間的延長,CD25+細胞百分率逐漸升高。NK細胞的標記(CD16、CD56)在TIL體外加IL-2培養過程中有先增高后降低的趨勢。因此,TIL在多種腫瘤(如腎癌和黑色素瘤)中具有抗自身腫瘤的特異性,可望為今后更有效地進行腫瘤的生物治療甚至預防提供強有力的依據和新的途徑。
目前分離TIL多數采用機械法或酶消化法,不僅花費大量人力物力,而且降低了分離后TIL的細胞活性。如何有效地分離TIL是急需解決的一個技術問題,為進一步研究腫瘤免疫微環境及腫瘤的生物治療提供一個有力的技術手段。
發明內容
本發明要解決的技術問題是,克服現有技術中的不足,提供一種腫瘤浸潤淋巴細胞的分離方法。
為解決技術問題,本發明的解決方案是:
提供一種腫瘤浸潤淋巴細胞的分離方法,包括如下步驟:
(1)以PBS緩沖液洗滌腫瘤組織塊后,置于培養皿中,加入5~10體積倍的胰酶消化液浸泡3小時;
(2)將浸泡處理后的腫瘤組織塊修剪成0.5mm3的顆粒狀后,置培養皿在37℃水浴搖床中,將腫瘤組織與胰酶消化液一并孵育1~2小時,使腫瘤組織塊充分消化打散;收集細胞懸液并過200目金屬濾網,分離收集單個細胞至50ml離心管中;用胰酶消化液洗滌培養皿2次,將所有液體轉移至該50ml離心管中;
(3)將前一步驟的50ml離心管放在冰上靜置10分鐘后,在50g離心機上離心處理2分鐘;棄底部沉淀,轉移上清液至另一50ml離心管中,在400g離心機上離心處理5分鐘,棄上清,加入3ml胰酶消化液重懸;
(4)向前一步驟經重懸的離心管中加入密度梯度離心液,進行密度梯度離心;然后收集云霧層細胞,轉移至另一玻璃管中,加入3ml胰酶消化液重懸;
加入的密度梯度離心液與細胞懸液的質量比為1:1~2,密度梯度離心過程中控制條件為500g×20分鐘,加速9減速4,溫度10℃;
(5)向前一步驟經重懸的離心管中加入1×紅細胞裂解液2ml,孵育5分鐘后加入2ml PBS緩沖液終止孵育;在400g離心機上離心5分鐘,棄上清;以PBS緩沖液洗滌細胞2次后,用含10wt%小牛血清的PBS緩沖液重懸;該離心管中溶解的細胞即為腫瘤浸潤淋巴細胞;
所述胰酶消化液是以Hanks'平衡液為溶劑,溶液中包括0.05wt%的collagenase type IV和0.001wt%的DNase I,每200ml Hanks'平衡液加入O.111g CaCl2。
本發明中所得腫瘤浸潤淋巴細胞的鑒定,是采用流式細胞術分離法來檢測細胞膜表面抗體,該方法具有如下步驟:
(1)利用胎盤藍對分離獲得的淋巴細胞進行染色,顯微鏡下進行細胞計數及活性測定。
(2)取出1×106個細胞于試管中(要求活細胞數>90-95%),加入熒光標記的抗體,混勻,4℃孵育30分鐘。用PBS洗滌2次,1500rpm/min,離心3分鐘,棄上清。加300ulPBS液(PH=7.4),流式細胞儀進行檢測鑒定。
與現有技術相比,本發明的有益效果在于:
在本發明中,酶消化結合機械法雙重高效分離腫瘤浸潤淋巴細胞,與機械法或酶消化法相比,本發明獲得腫瘤浸潤淋巴細胞存活率高且簡便易行。因此,能為進一步研究TIL在腫瘤中的作用提供強有力的保障。
通過胰酶消化、機械分離與淋巴細胞分離液相結合的方法從腫瘤組織中分離出腫瘤浸潤淋巴細胞。本發明為臨床研究腫瘤免疫微環境提供了不同類別、不同亞型的淋巴細胞,為探討腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)的免疫調節機理及在腫瘤的發生發展中的作用提供了便利的技術流程。其分離的腫瘤浸潤淋巴細胞存活率高達90%以上,便于應用推廣到各種實體瘤的淋巴細胞分離中,簡單易行。該方法分離所得的腫瘤浸潤淋巴細胞在體 外經白細胞介素2(IL-2)刺激后可大量增殖,具有特異高效的抗腫瘤活性,為臨床治療腫瘤提供強有力的依據和新的途徑。
具體實施方式
下面結合具體實施例進一步闡明本發明的內容:
本發明的腫瘤組織塊來源于臨床上手術過程中切除的腫瘤組織樣本,屬醫療遺棄廢物,臨床手術過程并非本發明涉及內容。
挑選腫瘤組織時,應確認腫瘤的部位、范圍,注意與周圍組織及壞死組織的鑒別。腫瘤組織離體后在最短時間內切取樣本(<30min),將腫瘤組織切成多塊直徑為0.5cm左右的組織塊,裝入滅菌凍存管中放入液氮轉移罐長期保存。
本發明中所用到的各種試劑均為市購產品進行配置獲得,本領域技術人員能夠熟練掌握。具體說明如下:
PBS緩沖液(磷酸緩沖鹽溶液),其質量濃度為10%,市購。
collagenase type IV,即膠原酶IV,市購,Invitrogen公司生產。
DNase I,即脫氧核糖核酸酶I,市購,Sigma-Aldrich公司生產。
Hanks'平衡液,即HBSS,市購,GENMED公司生產。
密度梯度離心液,即人淋巴細胞分離液,市購,Sigma-Aldrich公司生產。
具體實施例1
1、腫瘤浸潤淋巴細胞的分離
(1)以PBS緩沖液洗滌肝癌腫瘤組織塊后,置于培養皿中,加入5體積倍的胰酶消化液浸泡3小時;
(2)將浸泡處理后的腫瘤組織塊修剪成0.5mm3的顆粒狀后,置培養皿在37℃水浴搖床中,將腫瘤組織與胰酶消化液一并孵育1小時,使腫瘤組織塊充分消化打散;收集細胞懸液并過200目金屬濾網,分離收集單個細胞至50ml離心管中;用胰酶消化液洗滌培養皿2次,將所有液體轉移至該50ml離心管中;
(3)將前一步驟的50ml離心管放在冰上靜置10分鐘后,在50g離心機上離心處理2分鐘;棄底部沉淀,轉移上清液至另一50ml離心管中,在400g離心機上離心處理5分鐘,棄上清,加入3ml胰酶消化液重懸;
(4)向前一步驟經重懸的離心管中加入密度梯度離心液,進行密度梯度離心;然后收集云霧層細胞,轉移至另一玻璃管中,加入3ml胰酶消化液重懸;
加入的密度梯度離心液與細胞懸液的質量比為1:1,密度梯度離心過程中控制條件為500g×20分鐘,加速9減速4,溫度10℃;
(5)向前一步驟經重懸的離心管中加入1×紅細胞裂解液2ml,孵育5分鐘后加入2ml PBS緩沖液終止孵育;在400g離心機上離心5分鐘,棄上清;以PBS緩沖液洗滌細胞2次后,用含10wt%小牛血清的PBS緩沖液重懸;該離心管中溶解的細胞即為腫瘤浸潤淋巴細胞;
所述胰酶消化液是以Hanks'平衡液為溶劑,溶液中包括0.05wt%的collagenase type IV和0.001wt%的DNase I,每200ml Hanks'平衡液加入O.111g CaCl2。
2、腫瘤浸潤淋巴細胞的鑒定
(1)利用胎盤藍對分離獲得的淋巴細胞進行染色,顯微鏡下進行細胞計數及活性測定。
(2)取出1×106個細胞于試管中(要求活細胞數>90-95%),加入熒光標記的抗體,混勻,4℃孵育30分鐘。用PBS洗滌2次,1500rpm/min,離心3分鐘,棄上清。加300ulPBS液(PH=7.4),流式細胞儀進行檢測鑒定。
具體實施例2
與實施例1相比,本實施例中:分離對象為肺癌腫瘤組織塊;步驟(1)中胰酶消化液的加入量為10體積倍;步驟(2)中水浴搖床孵育時間為2個小時;步驟(4)中加入的密度梯度離心液與細胞懸液的質量比為1:2;其余內容均與實施例1相同。
具體實施例3
與實施例1相比,本實施例中:分離對象為胃癌腫瘤組織塊;步驟(1)中胰酶消化液的加入量為7體積倍;步驟(2)中水浴搖床孵育時間為1.5個小時;步驟(4)中加入的密度梯度離心液與細胞懸液的質量比為1:1.5;其余內容均與實施例1相同。

關 鍵 詞:
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