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樹突狀細胞及其制備方法和用途.pdf

摘要
申請專利號:

CN201410356051.8

申請日:

2014.07.23

公開號:

CN104288179A

公開日:

2015.01.21

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情:

授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 35/17申請日:20140723|||公開

IPC分類號:

A61K35/17(2015.01)I; C12N5/0784(2010.01)I; A61P35/00; A61P1/16; A61P31/20; A61K35/16(2015.01)N

主分類號:

A61K35/17

申請人:

武漢漢密頓生物科技股份有限公司

發明人:

姚惟琦; 武棟成

地址:

430063 湖北省武漢市武漢東湖高新技術開發區高新大道666號武漢生物技術研究院B6-423

優先權:

專利代理機構:

北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201

代理人:

李志東

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內容摘要

本發明提供了樹突狀細胞及其制備方法和用途。具體的,本發明提出了樹突狀細胞和細胞因子誘導的殺傷性細胞的組合在制備藥物中的用途,所述藥物用于治療或者抑制肝癌,其中,所述樹突狀細胞特異性識別肝癌病灶。根據本發明的實施例,樹突狀細胞和細胞因子誘導的殺傷性細胞的組合能夠有效治療或者抑制肝癌。

權利要求書

權利要求書
1.  樹突狀細胞和細胞因子誘導的殺傷性細胞的組合在制備藥物中的用途,所述藥物用于治療或者抑制肝癌,其中,所述樹突狀細胞特異性識別肝癌病灶,
優選地,所述樹突狀細胞是通過下列步驟獲得的:
(1)獲取外周血,所述外周血來自于攜帶所述病灶的個體;
(2)從所述外周血中分離單個核細胞;
(3)刺激所述單個核細胞向樹突狀細胞分化,以便獲得所述樹突狀細胞,
其中,
在步驟(3)中包括將所述單個核細胞與所述病灶的特異性抗原接觸,所述特異性抗原為甲胎蛋白和乙肝疫苗的至少之一,
任選地,所述個體進一步患有慢性乙肝。

2.  根據權利要求1所述的用途,其特征在于,步驟(3)進一步包括:
(3-1)利用巨噬細胞集落刺激因子和重組人白細胞介素4刺激所述單個核細胞向樹突狀細胞分化;
(3-2)將步驟(3-1)中所得到的細胞與甲胎蛋白和乙肝疫苗接觸,所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的重量濃度比例為1:1;以及
(3-3)將步驟(3-2)中所得到的細胞與IL-β、IL-6和TNF-α的至少之一接觸,以便獲得所述樹突狀細胞,
優選地,所述巨噬細胞集落刺激因子的濃度為1000U/mL,所述重組人白細胞介素4的濃度為500U/mL,
優選地,所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的濃度分別獨立地為40~60微克/毫升。

3.  根據權利要求1所述的用途,其特征在于,所述樹突狀細胞和細胞因子誘導的殺傷性細胞的組合是通過將所述樹突狀細胞和所述細胞因子誘導的殺傷性細胞進行共培養獲得的,
其中,
在所述共培養時,所述樹突狀細胞與所述細胞因子誘導的殺傷性細胞的接種比例為1:8~12,優選1:10。

4.  根據權利要求3所述的用途,其特征在于,所述細胞因子誘導的殺傷性細胞是通過下列步驟獲得的:
(4-1)利用IFN-γ刺激步驟(2)中所獲得的單個核細胞24小時,其中,所述IFN-γ的濃度為1000U/ml;以及
(4-2)將步驟(4-1)中所得到的細胞與CD3單克隆抗體和重組人白細胞介素2接觸,以便獲得所述細胞因子誘導的殺傷性細胞,其中,所述CD3單克隆抗體的濃度為50ng/ml,重組人白細胞介素2的濃度500U/ml。

5.  一種制備樹突狀細胞的方法,其中,所述樹突狀細胞特異性識別肝癌病灶,所述方法包括:
(1)獲取外周血,所述外周血來自于攜帶所述病灶的個體;
(2)從所述外周血中分離單個核細胞;
(3)刺激所述單個核細胞向樹突狀細胞方向分化,以便獲得所述樹突狀細胞,
其中,
在步驟(3)中包括將所述單個核細胞與所述病灶的特異性抗原接觸,所述特異性抗原為甲胎蛋白和乙肝疫苗的至少之一,
優選地,步驟(3)進一步包括:
(3-1)利用巨噬細胞集落刺激因子和重組人白細胞介素4刺激所述單個核細胞向樹突狀細胞分化;
(3-2)將步驟(3-1)中所得到的細胞與甲胎蛋白和乙肝疫苗接觸,所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的重量濃度比例為1:1;以及
(3-3)將步驟(3-2)中所得到的細胞與IL-β、IL-6和TNF-α的至少之一接觸,以便獲得成熟的樹突狀細胞,
優選地,所述巨噬細胞集落刺激因子的濃度為1000U/mL,所述重組人白細胞介素4的濃度為500U/mL。

6.  根據權利要求5所述的方法,其特征在于,所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的濃度分別獨立地為40~60微克/毫升。

7.  一種藥物,所述藥物用于治療或者預防肝癌,其特征在于,所述藥物包括:
樹突狀細胞和細胞因子誘導的殺傷性細胞的組合,
其中,所述樹突狀細胞特異性識別肝癌病灶。

8.  根據權利要求7所述的藥物,其特征在于,所述樹突狀細胞是通過權利要求5或6所述的方法制備的。

9.  一種樹突狀細胞,所述樹突狀細胞特異性識別肝癌病灶。

10.  根據權利要求9所述的樹突狀細胞,其特征在于,所述樹突狀細胞是通過權利要求5或6所述的方法制備的。

說明書

說明書樹突狀細胞及其制備方法和用途
技術領域
本發明涉及生物醫藥領域,具體的,本發明涉及樹突狀細胞及其制備方法和用途,更具體的,本發明涉及樹突狀細胞和細胞因子誘導的殺傷性細胞的組合在制備藥物中的用途、制備樹突狀細胞的方法、藥物以及樹突狀細胞。 
背景技術
肝癌是中國第二位腫瘤殺手,每年死亡人數30多萬,占全世界肝癌死亡總數的55%。目前治療肝癌的主要手段為手術切除、肝移植、局部消融治療、肝動脈介入治療、放射治療、化學治療和其他治療。 
在世界任何地區都同樣發現,任何原因導致的慢性肝病都可能在肝癌發生和發展過程中起著重要的作用。流行病學和實驗研究均表明病毒性肝炎與原發性肝癌的發生有著特定的關系,目前比較明確的與肝癌有關系的病毒性肝炎有乙型、丙型和丁型3種,其中以乙型肝炎與肝癌關系最為密切,主要表現為以下幾點:肝細胞癌與HBsAg攜帶者的發生率相平行。 
然而,現有肝癌的治療手段仍有待改進。 
發明內容
本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。為此,本發明的一個目的在于提出一種具有能夠有效治療肝癌的手段。 
在本發明的第一方面,本發明提出了一種樹突狀細胞(dendritic cell,DC)和細胞因子誘導的殺傷性細胞(cytokine-induced killer,CIK)的組合在制備藥物中的用途,所述藥物用于治療或者抑制肝癌,其中,所述樹突狀細胞特異性識別肝癌病灶。 
樹突狀細胞是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞,成熟的樹突狀細胞能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原,并能有效激活初始型T細胞,處于啟動、調控、并維持免疫應答的重要環節。 
細胞因子誘導的殺傷性細胞是將人的外周血PBMC(Peripheral Blood Monoclonal Cells)在體外經過多種細胞因子共同培養一段時間后獲得的T淋巴細胞,由于該細胞同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子,故又稱為NK細胞(自然殺傷細胞)樣T淋巴細胞。細 胞因子誘導的殺傷性細胞增殖能力強,在體外培養兩周左右可以使主要效應細胞(CD3+、CD56+)增值1000倍以上;細胞因子誘導的殺傷性細胞毒作用強,遠優于傳統的LAK細胞和細胞因子γ干擾素、白細胞介素2;細胞因子誘導的殺傷性細胞具有廣泛的殺瘤作用,在不傷害正常細胞的條件下通過多種途徑靶向殺死腫瘤細胞;細胞因子誘導的殺傷性細胞還具有免疫調節作用。DC與CIK細胞聯合應用將完成識別腫瘤細胞、殺滅腫瘤細胞的全過程。研究表明DC細胞能夠使抑制T細胞(CD4+CD25+)的數量減少、活性減弱,所以共同培養DC、CIK細胞與單純培養CIK細胞相比在細胞增殖能力、效應細胞(CD3+、CD8+、CD3+CD56+)數量以及對腫瘤細胞的細胞毒作用等方面顯著增強。 
腫瘤的DC-CIK免疫細胞治療是繼手術、放療、化療后的第四種抗腫瘤治療模式,是向腫瘤患者輸入自體的、在體外擴增并激活的免疫細胞,直接殺傷腫瘤細胞或激發機體抗腫瘤免疫反應,從而達到治療腫瘤的目的。對于實體瘤手術后病人,該治療可清除體內殘余腫瘤細胞、明顯降低腫瘤手術后的轉移和復發幾率;對于放化療病人,該治療可清除殘存腫瘤細胞、增強放化療的敏感性、減輕放化療的毒副作用;對于無法手術及放化療的中晚期腫瘤患者,該治療可以抑制腫瘤的增長、增強免疫力、改善生活質量、延長生命周期。腫瘤免疫細胞治療在全球的累計治療病例超過數萬例,療效和安全性都比較令人滿意。 
因此,樹突狀細胞聯合細胞因子誘導的殺傷性細胞免疫療法即DC-CIK免疫療法引入到抗肝癌的治療中,改善現有技術中抗肝癌免疫效應細胞的殺傷作用,通過細胞因子的添加,尋找新的樹突狀細胞和細胞因子聯合培養誘導的殺傷性細胞培養方法,在生物技術領域意義重大。 
根據本發明的實施例,所述樹突狀細胞可以是通過下列步驟獲得的:(1)獲取外周血,所述外周血來自于攜帶所述病灶的個體;(2)從所述外周血中分離單個核細胞;(3)刺激所述單個核細胞向樹突狀細胞分化,以便獲得所述樹突狀細胞,其中,在步驟(3)中包括將所述單個核細胞與所述病灶的特異性抗原接觸,所述特異性抗原為甲胎蛋白和乙肝疫苗的至少之一。 
根據本發明的實施例,所述個體進一步患有慢性乙肝。發明人驚奇地發現,本發明的樹突狀細胞(DC)與細胞因子誘導的殺傷性細胞的組合能夠有效的治療慢性乙肝性肝癌。 
根據本發明的實施例,步驟(3)進一步包括:(3-1)利用巨噬細胞集落刺激因子和重組人白細胞介素4刺激所述單個核細胞向樹突狀細胞分化;(3-2)將步驟(3-1)中所得到的細胞與甲胎蛋白和乙肝疫苗接觸,所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的重量濃度比例為1:1;以及(3-3)將步驟(3-2)中所得到的細胞與IL-β、IL-6和TNF-α的至少之一接觸,以便獲得所述樹突狀細胞。 
原發性肝癌患者血清中甲胎蛋白(α-fetoprotein)AFP升高可達250ug~6mg/ml,(甚 至達到9mg/ml),相當于正常人的數十倍乃至數萬倍,因此血清AFP的測定是目前診斷原發性肝癌最常用、較敏感、特異性較強的早期診斷方法,現已廣泛用于肝癌的普查、診斷、判斷治療效果、預測復發中。AFP與腫瘤大小有一定的相關性,即腫瘤越小,陽性率越低,AFP也與病理類型相關,癌細胞分化I級和II級,AFP相對較低,Ⅲ級時相對較高。近年來采用AFP異質體和AFP同時測定,可使肝癌診斷陽性率提高至92%,假陽性低于15%。 
發明人驚奇地發現,通過采用AFP(甲胎蛋白)進行刺激而得到樹突狀細胞能夠顯著提高所得到的樹突狀細胞對肝癌病灶的特異性識別。 
根據本發明的實施例,所述巨噬細胞集落刺激因子的濃度為1000U/mL,所述重組人白細胞介素4的濃度為500U/mL。 
根據本發明的實施例,所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的濃度分別獨立地為40~60微克/毫升,最優選50微克/毫升。 
根據本發明的實施例,所述樹突狀細胞和細胞因子誘導的殺傷性細胞的組合是通過將所述樹突狀細胞和所述細胞因子誘導的殺傷性細胞進行共培養獲得的,其中,在所述共培養時,所述樹突狀細胞與所述細胞因子誘導的殺傷性細胞的接種比例為1:8~12,優選1:10。 
根據本發明的實施例,所述細胞因子誘導的殺傷性細胞是通過下列步驟獲得的:(4-1)利用IFN-γ刺激步驟(2)中所獲得的單個核細胞24小時,其中,所述IFN-γ的濃度為1000U/ml;以及(4-2)將步驟(4-1)中所得到的細胞與CD3單克隆抗體和重組人白細胞介素2接觸,以便獲得所述細胞因子誘導的殺傷性細胞,其中,所述CD3單克隆抗體的濃度為50ng/ml,重組人白細胞介素2的濃度500U/ml。 
在本發明的第二方面,本發明提出了一種制備樹突狀細胞的方法,其中,所述樹突狀細胞特異性識別肝癌病灶。根據本發明的實施例,所述方法包括:(1)獲取外周血,所述外周血來自于攜帶所述病灶的個體;(2)從所述外周血中分離單個核細胞;(3)刺激所述單個核細胞向樹突狀細胞方向分化,以便獲得所述樹突狀細胞,其中,在步驟(3)中包括將所述單個核細胞與所述病灶的特異性抗原接觸,所述特異性抗原為甲胎蛋白和乙肝疫苗的至少之一。 
根據本發明的實施例,步驟(3)可以進一步包括:(3-1)利用巨噬細胞集落刺激因子和重組人白細胞介素4刺激所述單個核細胞向樹突狀細胞分化;(3-2)將步驟(3-1)中所得到的細胞與甲胎蛋白和乙肝疫苗接觸,所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的重量濃度比例為1:1;以及(3-3)將步驟(3-2)中所得到的細胞與IL-β、IL-6和TNF-α的至少之一接觸,以便獲得所述樹突狀細胞。 
根據本發明的實施例,所述巨噬細胞集落刺激因子的濃度為1000U/mL,所述重組人 白細胞介素4的濃度為500U/mL。 
根據本發明的實施例,所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的濃度分別獨立地為40~60微克/毫升,最優選50微克/毫升。 
在本發明的第三方面,本發明提出了一種藥物,所述藥物用于治療或者預防肝癌。根據本發明的實施例,所述藥物包括:樹突狀細胞和細胞因子誘導的殺傷性細胞的組合,其中,所述樹突狀細胞特異性識別肝癌病灶。 
根據本發明的實施例,所述樹突狀細胞是通過前面所述的方法制備的。 
在本發明的第四方面,本發明提出了一種樹突狀細胞,所述樹突狀細胞特異性識別肝癌病灶。 
根據本發明的實施例,所述樹突狀細胞是通過前面所述的方法制備的。 
具體地,根據本發明的實施例,本發明提供了一種用于抗肝癌的樹突狀細胞聯合細胞因子誘導的殺傷性細胞培養方法,其包括下列步驟: 
步驟a:自體血漿的制備 
在生物安全柜中將注射器中的40ml-60ml抗凝全血平均分裝到2支50mL無菌離心管中,用離心機離心,離心轉速為2500rpm,離心10min,離心完成后吸取上層血漿,56℃,30min滅活補體,置于4℃水浴中放置15分鐘,再用離心機離心,離心速度為2500rpm,離心20分鐘,轉移上清液至新的離心管。標記,置于-20℃冰箱中保存; 
步驟b:單個核細胞的分離 
向步驟a中所述的離心后未被吸取的血細胞中加入緩沖鹽溶液25mL,稀釋血細胞,邊吹打邊旋轉離心管,混勻。取30ml混勻的稀釋血緩慢加到裝有淋巴細胞分離液的50mL離心管內。用離心機離心,離心轉速為2100rpm離心30分鐘;吸出白膜層至裝有30ml緩沖鹽溶液的離心管中,用離心機離心,離心速度為2100rpm,離心15分鐘; 
步驟c:離心洗滌、計數 
將上述步驟b中得到的細胞懸液,棄上清,每管加5mL緩沖鹽溶液,重懸細胞沉淀,并轉移至一管,再吸取適量緩沖鹽溶液漂洗各管后收集殘留細胞,定容至30mL,留樣計數。用離心機離心,離心轉速1500rpm,離心10分鐘; 
步驟d:重懸細胞、接種 
將上述步驟c中得到的細胞懸液,棄上清,取5mL培養液重懸細胞沉淀,移入表面積為75平方厘米的培養瓶中,每瓶1*106/mL的密度,置于37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養箱中,孵育2小時; 
步驟e:DC細胞的培養及鑒定 
從上述步驟d所述的培養瓶中吸出懸浮細胞備用,加入rhGM-CSF1000U/ml、rhIL-4 500U/ml,刺激細胞向DC細胞分化,擴瓶;在培養的第5天加入甲胎蛋白及乙肝疫苗50μg/ml;在培養的第6天加入IL-β、IL-6、TNFα細胞因子;第7天收獲DC細胞,臺盼藍染色檢測細胞活力,流式細胞儀檢測DC細胞CD1a、CD11c和CD83免疫表型標記; 
步驟f:CIK細胞的培養與鑒定 
將步驟e中的所述的懸浮細胞重新接種于培養瓶中,加入IFN-γ1000U/ml;24h后加入CD350ng/ml單克隆抗體和rhIL-2500U/ml;培養;第7天取樣,臺盼藍染色檢測細胞活力,流式細胞儀檢測CIK細胞CD3+CD56+免疫表型標記。 
步驟g:DC-CIK細胞聯合培養 
將收集的DC細胞加入CIK細胞聯合培養,最后一次補加培養基后取樣進行細菌、真菌、內毒素檢測、確認檢測結果陰性后第4天收獲細胞,臺盼藍染色檢測細胞活力,流式細胞儀檢測CIK細胞CD3+CD56+免疫表型標記; 
步驟h:細胞收獲 
將細胞培養袋中的細胞懸液混勻后分裝到50ml離心管中,45ml/管,配平。用離心機離心,離心轉速為1500rpm,10min。棄上清,每管加5ml含有稀釋血漿的生理鹽水,吹打均勻,每8管合1管,再用少量生理鹽水漂洗各離心管收集殘留細胞,配平。用離心機離心,離心轉速為1500rpm,10min。棄上清,加生理鹽水重懸,合為1管,配平。用離心機離心,離心轉速為1500rpm,10min。棄上清,輕彈離心管底,用移液管加10mL細胞重懸液,輕輕吹打,重懸細胞,先吸上清沿管壁流下至沉淀散開再吹打,再加10mL細胞重懸液和5mL白蛋白混勻。準備生理鹽水袋放入超凈臺,酒精紗布擦拭管口處,打開管口塑料蓋露出軟塞,打開50ml注射器包裝,傾斜離心管將注射器伸入吸出細胞懸液。更換注射器的針頭為9號針頭,鹽水袋向上,將細胞懸液注入,注射完后抽出氣體,裝入包裝袋,傳遞窗傳出。 
另外,根據本發明上述實施例的細胞培養基還可以具有如下附加的技術特征:所述步驟b中所述的緩沖鹽溶液為PBS溶液。 
根據本發明的實施例,所述步驟a中所述的淋巴細胞分離液為ficoll分離液。 
根據本發明的實施例,所述步驟b中的白膜層為離心完成后分為3層的中間層。 
根據本發明的實施例,所述步驟d中的培養液為GT-T551培養液。 
根據本發明的實施例,所述步驟e中所述的擴瓶是指在培養的第3天1瓶擴3瓶,第6天3瓶擴9瓶。 
根據本發明的實施例,所述步驟f中所述的培養為擴瓶培養。 
根據本發明的實施例,所述步驟f中所述的培養為培養袋中培養。 
根據本發明的實施例,所述步驟g中所述的DC細胞和CIK細胞聯合的比例為1:10。 
根據本發明的實施例,所述步驟h中所述的稀釋血漿的含量為4%。 
具體實施方式
下面詳細描述本發明的實施例。下面通過參考描述的實施例是示例性的,僅用于解釋本發明,而不能理解為對本發明的限制。 
實施例1 
肝內膽管細胞癌術后患者自體血DC-CIK免疫細胞治療,具體內容如下: 
1、臨床資料 
病例1,女,69歲,肝內膽管細胞癌,為手術后病理檢查確診病例。 
2、主要材料 
(a)耗材:淋巴細胞分離液(GE healthcare),GT-T551培養基(購自寶日醫生物技術有限公司),rhGM-CSF、rhIL-4、rhIL-2、IL-β、IL-6、IFN-γ、TNFα、甲胎蛋白、乙肝疫苗、CD3單克隆抗體(北京遠策藥業責任有限公司),50ml離心管、10ml離心管、5ml移液管、25ml移液管、巴氏小管、細胞培養瓶、細胞培養袋(Thermo),慶大霉素(購自宜昌人福藥業責任有限公司)。 
(b)儀器:流式細胞儀(beckman)、生物安全柜(力康)、細胞培養箱(力康)、高速離心機(久保田)、倒置顯微鏡(江南)、超低溫冰箱(海爾)、液氮儲存罐(Thermo)。 
具體步驟: 
(1)用含有抗凝劑的注射器抽取肝癌患者外周血45mL; 
(2)在生物安全柜中將50mL抗凝全血平分到兩支50mL的無菌離心管中,2500rpm離心10min; 
(3)離心完成后將上層血漿(每管約10mL)轉移至新的離心管中,56℃,30min滅活補體,4℃水浴15min,2500rpm*20min離心去除纖維蛋白,將上清轉移至新的離心管,置于-20℃冰箱備用; 
(4)向剩余的血細胞中加入PBS每管25mL,邊吹打邊旋轉離心管至混勻重點吹打管壁和管底,留1mL稀釋血做乙肝五項、梅毒、艾滋、丙肝檢測。 
(5)將混勻的稀釋血每30ml緩慢加到裝有15mLficoll的50ml離心管內。2100rpm離心30min,慢升慢降; 
(6)離心完成后分為3層,用巴氏吸管小心吸取中間的白膜層轉至裝有30mlPBS的離心管中,每管42.5mL,配平離心2100rpm,10min; 
(7)棄上清,每管加5mL的PBS重懸細胞,輕柔吹打合為一管,再用5mL的PBS 漂洗各管定容至30ml,留樣計數,擰緊蓋子離心2100rpm,10min; 
(8)棄上清,用GT-T551重懸細胞,步驟(7)中細胞計數為7.3*107,按每瓶1*106/ml的密度接種于75cm2的培養瓶中,種2瓶,置于溫度為37℃、CO2%飽和濕度的細胞培養箱中孵育2h(記為第0天)。 
(9)吸出非貼壁細胞備用,向貼壁細胞中加入rhGM-CSF1000U/ml(濃度均為終濃度)、rhIL-4500U/ml,刺激細胞向DC細胞分化,培養的第3天細胞貼壁率約為85%,培養液顏色變為橘黃,1瓶擴3瓶;第6天細胞貼壁率約為80%,培養液顏色變為橘黃1瓶再擴3瓶;在培養的第5天加入乙肝疫苗50μg/ml,按照1:1的濃度加入甲胎蛋白,刺激抗原特異性細胞的產生;在培養的第6天加入IL-β、IL-6、TNFα細胞因子,每種細胞因子的終濃度為10-100ng/ml,刺激DC細胞成熟;第7天收獲DC細胞;取樣,臺盼藍染色檢測細胞活力,流式細胞儀檢測DC細胞CD1a、CD11c和CD83免疫表型標記; 
(10)將步驟(9)中的懸浮細胞重新接種于培養瓶中,加入IFN-γ1000U/ml; 
a、1天后加入50ng/ml的CD3單克隆抗體和rhIL-2500U/ml刺激CIK細胞的生長和增殖; 
b、第4天鏡下觀察細胞數量多、結團較大、培養基顏色變為橘黃色,將細胞轉移到培養袋中,體積擴增到200ml; 
c、第5天鏡下觀察細胞體積增大、胞漿少、核大,結團多,培養基變為橘黃色補液至600ml; 
d、第6天鏡下觀察細胞生長狀態良好,培養基顏色金黃補液至1200ml,混勻,取樣涂板做細菌、真菌檢測; 
(11)將DC細胞按1:10的比例加入CIK細胞培養袋中混勻,繼續培養; 
(12)第9天擴袋。將1200ml培養液分裝至兩個培養袋中,其中將600ml的培養液分裝至a袋中,并利用補充培養基至1200ml,將另外600ml的培養液分裝至b袋中,并利用補充培養基至1500ml,兩袋都要取樣質檢; 
(13)第12天收獲a袋細胞 
a、分裝:將細胞培養袋中的細胞懸液混勻后分裝到支50ml離心管中,45ml/管,共27管,配平。留5ml細胞懸液樣品做內毒素和革蘭氏染色檢測及計數; 
b、離心收集細胞:1500rpm*10min; 
c、第一次離心洗滌:棄上清,每管加5ml生理鹽水(含有4%的稀釋血漿),吹打均勻,每8管合1管,共4管,再用少量生理鹽水漂洗各離心管收集殘留細胞,配平, 1500rpm*10min; 
d、第二次離心洗滌:棄上清,加生理鹽水重懸,合為1管,配平。用離心機離心,離心轉速為1500rpm,離心10min; 
e、重懸細胞:棄上清,先輕彈離心管底,使細胞沉淀松散。再用10ml移液管加10ml細胞重懸液,輕輕吹打,重懸細胞,開始不要直接吸出沉淀,要先吸上清沿管壁流下至沉淀散開再吹打(檢查是否有顆粒沉淀,如果吹不散要使用70um過濾器過濾細胞沉淀)再加5ml10細胞重懸液和5ml白蛋白混勻。 
f、將細胞懸液注入將生理鹽水袋:準備生理鹽水袋放入超凈臺,酒精紗布擦拭管口處,打開管口塑料蓋露出軟塞,打開50ml注射器包裝,不要碰到注射器刻度線以下的管體,傾斜離心管將注射器伸入吸出細胞懸液,保證無菌操作。更換注射器的針頭為9號針頭,鹽水袋向上,將細胞懸液注入,同時觀察是否有沉淀,注射完后抽出相應體積的氣體。 
g、檢查確認:再次檢查是否有沉淀,檢查注射針孔處是否有液體滲出確定無誤后裝入包裝袋,傳遞窗傳出。 
(14)第13天收獲b袋細胞,方法同步驟(13) 
(15)a、b細胞計數分別為3.54*109、4.57*109; 
實施例2: 
原發性肝癌Ⅱ期患者自體血DC-CIK免疫細胞治療,具體內容如下: 
1、臨床資料 
病例2,男,66歲,原發性肝癌Ⅱ期,為手術后病理檢查確診病例。 
2、主要材料 
(a)耗材:淋巴細胞分離液(GE healthcare),GT-T551培養基(來源于寶日醫生物技術有限公司),rhGM-CSF、rhIL-4、rhIL-2、IL-β、IL-6、IFN-γ、TNFα、乙肝疫苗、CD3單克隆抗體(北京遠策藥業責任有限公司),50ml離心管、10ml離心管、5ml移液管、25ml移液管、巴氏小管、細胞培養瓶、細胞培養袋(Thermo fisher),慶大霉素(來源于宜昌人福藥業責任有限公司)。 
(b)流式細胞儀(bekman)、生物安全柜(力康)、細胞培養箱(力康)、高速離心機(久保田)、倒置顯微鏡(江南)、超低溫冰箱(海爾)、液氮儲存罐(Thermo)。 
(1)用含有抗凝劑的注射器抽取肝癌患者外周血55ml; 
(2)在生物安全柜中將50ml抗凝全血平分到兩支50ml的無菌離心管中,2500rpm離心10min; 
(3)離心完成后將上層血漿(每管約12.5ml)轉移至新的離心管中,56℃,30min滅活補體,4℃水浴15min,2500rpm*20min離心去除纖維蛋白,將上清轉移至新的離心管,置于-20℃冰箱備用; 
(4)向剩余的血細胞中加入PBS每管25ml,邊吹打邊旋轉離心管至混勻重點吹打管壁和管底,留1ml稀釋血做乙肝五項、梅毒、艾滋、丙肝檢測。 
(5)將混勻的稀釋血每30ml緩慢加到裝有15ml ficoll的50ml離心管內。2100rpm離心30min,慢升慢降; 
(6)離心完成后分為3層,用巴氏吸管小心吸取中間的白膜層轉至裝有30mlPBS的離心管中,每管42.5ml,配平離心2100rpm,10min; 
(7)棄上清,每管加5mlPBS重懸細胞,輕柔吹打合為一管,再用5mlPBS漂洗各管定容至30ml,留樣計數,擰緊蓋子離心2100rpm,10min; 
(8)棄上清,用GT-T551重懸細胞,步驟(7)中細胞計數為8.1*107按按照每瓶1*106/ml的密度接種于75cm2的培養瓶中,種2瓶,置于細胞培養箱中,37℃、CO2%孵育2h(記為第0天)。 
(9)吸出非貼壁細胞備用,加入rhGM-CSF1000U/ml(濃度均為終濃度)、rhIL-4500U/ml,刺激細胞向DC細胞分化,在培養的第3天細胞貼壁率約為75%,培養液顏色變為橘黃,1瓶擴3瓶;;在培養的第5天加入乙肝疫苗50μg/ml,刺激抗原特異性細胞的產生;在培養第6天細胞貼壁率約為80%,培養液顏色變為橘黃1瓶再擴3瓶,加入IL-β、IL-6、TNFα細胞因子,每種細胞因子的終濃度為10-100ng/ml,刺激DC細胞成熟;第7天收獲DC細胞;取樣,臺盼藍染色檢測細胞活力,流式細胞儀檢測DC細胞CD1a、CD11c和CD83免疫表型標記; 
(10)將步驟(9)中的懸浮細胞重新接種于培養瓶中,加入IFN-γ1000U/ml; 
a、1天后加入50ng/ml的CD3單克隆抗體和rhIL-2500U/ml刺激CIK細胞的生長和增殖 
b、第4天鏡下觀察細胞數量多,結團較大、多、培養基顏色變為金黃色,將細胞轉移到培養袋中,體積擴增到300ml; 
c、第5天鏡下觀察細胞體積增大、胞漿少、核大,結團多,培養基變為橘黃色補液至600ml; 
d、第6天鏡下觀察細胞生長狀態良好,培養基顏色金黃補液至1200ml,混勻,取樣涂板做細菌、真菌檢測; 
e、第7天收獲CIK細胞;臺盼藍染色檢測細胞活力,流式細胞儀檢測CIK細胞CD3+CD56+ 免疫表型標記; 
(11)將DC細胞按1:10的比例加入CIK細胞培養袋中混勻,繼續培養; 
(12)第9天擴袋。將1200ml培養液分裝至兩個培養袋中,其中將600ml的培養液分裝至a袋中,并利用補充培養基至1200ml,將另外600ml的培養液分裝至b袋中,并利用補充培養基至1500ml,兩袋都要取樣質檢; 
(13)第12天收獲a袋細胞。 
a、分裝:將細胞培養袋中的細胞懸液混勻后分裝到支50ml離心管中,45ml/管,共27管,配平。留5ml細胞懸液樣品做內毒素和革蘭氏染色檢測及計數; 
b、離心收集細胞:1500rpm*10min; 
c、第一次離心洗滌:棄上清,每管加5ml生理鹽水(含有4%的稀釋血漿),吹打均勻,每8管合1管,共4管,再用少量生理鹽水漂洗各離心管收集殘留細胞,配平,1500rpm*10min; 
d、第二次離心洗滌:棄上清,加生理鹽水重懸,合為1管,配平。1500rpm*10min; 
e、重懸細胞:棄上清,先輕彈離心管底,使細胞沉淀松散。再用10ml移液管加10ml細胞重懸液,輕輕吹打,重懸細胞,開始不要直接吸出沉淀,要先吸上清沿管壁流下至沉淀散開再吹打(檢查是否有顆粒沉淀,如果吹不散要使用70um過濾器過濾細胞沉淀)再加5ml10細胞重懸液和5ml白蛋白混勻。 
f、將細胞懸液注入將生理鹽水袋:準備生理鹽水袋放入超凈臺,酒精紗布擦拭管口處,打開管口塑料蓋露出軟塞,打開50ml注射器包裝,不要碰到注射器刻度線以下的管體,傾斜離心管將注射器伸入吸出細胞懸液,保證無菌操作。更換注射器的針頭為9號針頭,鹽水袋向上,將細胞懸液注入,同時觀察是否有沉淀,注射完后抽出相應體積的氣體。 
g、檢查確認:再次檢查是否有沉淀,檢查注射針孔處是否有液體滲出確定無誤后裝入包裝袋,傳遞窗傳出。 
(14)第13天收獲b袋細胞,方法同步驟(13)。 
(15)細胞計數分別為3.7*109、4.72*109。 
在本說明書的描述中,參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中,對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且,描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何的 一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。 
盡管已經示出和描述了本發明的實施例,本領域的普通技術人員可以理解:在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型,本發明的范圍由權利要求及其等同物限定。 

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樹突 細胞 及其 制備 方法 用途
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