• / 6
  • 下載費用:30 金幣  

蛋白多糖復合物.pdf

摘要
申請專利號:

CN201110122299.4

申請日:

20110512

公開號:

CN102188693B

公開日:

20131030

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:

IPC分類號:

A61K38/16,A61K8/73,A61K8/64,A23L1/30,A61P3/06,A61P7/02,A61P9/10,A61P25/00,A61P43/00,A61K31/727,A61K31/728,A61K31/737

主分類號:

A61K38/16,A61K8/73,A61K8/64,A23L1/30,A61P3/06,A61P7/02,A61P9/10,A61P25/00,A61P43/00,A61K31/727,A61K31/728,A61K31/737

申請人:

湛江市索奇生物技術有限公司

發明人:

李國躍,吳怡

地址:

524022 廣東省湛江市開發區人民大道中26號合得利工業大夏8層

優先權:

CN201110122299A

專利代理機構:

廣州新諾專利商標事務所有限公司

代理人:

李國釗

PDF完整版下載: PDF下載
內容摘要

本發明屬于生物化學技術領域,公開了一種新型蛋白多糖復合物。所述新型蛋白多糖復合物由質量百分比為M%的金屬硫蛋白和[100-M]%的糖胺聚糖組成,其中,0

權利要求書

1.一種蛋白多糖復合物,其特征在于,由金屬硫蛋白和糖胺聚糖制成,所述糖胺聚糖從海洋貝類動物提取,所述金屬硫蛋白與糖胺聚糖的質量比為4~5:1。2.根據權利要求1所述的一種蛋白多糖復合物,其特征在于,所述金屬硫蛋白通過動物體內組織獲取或由基因工程方法獲取。

說明書

技術領域

本發明屬于生物化學技術領域,具體涉及一種新型蛋白多糖復合物。?

背景技術

金屬硫蛋白(MT)化學名為金屬硫組氨酸三甲基內鹽,化學結構特殊,是一類富含半胱氨酸、廣泛存在于生物體內的低分子量、富含金屬及巰基的非酶蛋白。MT的分子量介于6000~7000Da之間,通常含有61個氨基酸,其中20個為半胱氨酸,可以與7個二價金屬離子結合形成兩個獨立的金屬簇。MT對金屬離子有特定的親和力,其對金屬的結合序列為:Fe2+<Co2+<Zn2+<Pb2+<Cd2+<Cu2+~Ag2+<Bi2+<Hg2+,是機體內唯一一種在金屬代謝中起明確作用的小分子蛋白質,結合重金屬是MT蛋白區別于其他蛋白質的重要特性。MT在生物體內具有多種作用,包括解除重金屬的毒害,清除自由基,參與微量元素代謝,促進機體免疫功能以及抗輻射、抗衰老等。同時,MT能抑制脂質(如血脂)的過氧化反應,可降低血液粘度,改善血液循環,能達到防治心腦血管疾病的目的和穩定生物膜等多種生物學作用。因此,MT可應用于食品、化妝品和醫藥等領域。?

糖胺聚糖(GAGs)存在于動物細胞的表面和細胞外基質,是一種長鏈多糖,是由含已糖醛酸和己糖胺成分的重復二糖單元連接成的直鏈雜多糖。糖胺聚糖的通式為:[己糖醛酸→己糖胺]n,n隨種類而異,一般在30~250之間。二糖單元中至少有1個單糖殘基帶有負電荷的羧基或硫酸基。在體內1條或多條糖胺聚糖和1個核心蛋白共價連接形成蛋白聚糖,但透明質酸除外。按單糖殘基、殘基間連鍵的類型以及硫酸基的數目和位置,糖胺聚糖可分為:透明質酸,4-硫酸軟骨素,6-硫酸軟骨素,硫酸皮膚素,硫酸角質素,肝素,和硫酸乙酰肝素。GAGs通過結合受體蛋白介導重要的生物學機制,比如保護蛋白免受降解、抗凝血、維持或抑制細胞生長、黏附和抗黏附、生物過濾器、促進或抑制血管形成、誘導神經軸突生長,以及在正常發育和病理條件下結合、貯存及向靶細胞釋放生長因子和參與信號轉導等生物活性。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種新型蛋白多糖復合物,其功能特性和物理穩定性均優于獨立的金屬硫蛋白或糖胺聚糖。?

為達到上述目的,本發明采用如下技術方案:?

新型蛋白多糖復合物,由質量百分比為M%的金屬硫蛋白和[100-M]%的糖胺聚糖組成,?其中,0<M<100。?

進一步,所述金屬硫蛋白與糖胺聚糖的最佳質量比為4~5∶1。?

作為優選,所述金屬硫蛋白通過動物體內組織獲取或由基因工程方法獲取。?

作為優選,所述糖胺聚糖通過動物組織提取。?

進一步,所述糖胺聚糖為透明質酸,或4-硫酸軟骨素,或6-硫酸軟骨素,或硫酸皮膚素,或硫酸角質素,或肝素,或硫酸乙酰肝素,或它們的混合物。?

本發明所述的新型蛋白多糖復合物綜合了兩組分的功能特性,使其功能特性和理化穩定性比單獨的MT或GAGs都有改善,同時提高了MT的某些生理活性例如熱穩定性。使MT與GAGs在食品、化妝品、醫藥等領域應用更加廣泛。?

具體實施方式

本發明所述的新型蛋白多糖復合物,是由質量百分比為M%的金屬硫蛋白和[100-M]%的糖胺聚糖組成,其中,0<M<100。所述的金屬硫蛋白優選通過動物體內組織獲取或由基因工程方法獲取。所述的糖胺聚糖優選通過動物組織提??;所述的糖胺聚糖包括透明質酸、4-硫酸軟骨素、6-硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質素、肝素和硫酸乙酰肝素,或它們的混合物。?

一、MT-GAGs最佳質量配比實驗:?

1、MT的制備。?

采用現有的提取方法從動物肝臟中提取出活性Zn-MT,并制成凍干粉。?

2、GAGs的制備。?

采用現有的提取方法從海洋貝類動物提取出的GAGs,并制成水溶液。?

3、新型蛋白多糖復合物即MT-GAGs的制備。?

取一特定濃度的GAGs水溶液,按不同的質量比加入MT凍干粉,攪拌混勻,得MT-GAGs復合物。?

4、MT-GAGs復合物的分離?

取不同質量比制備的MT-GAGs復合物,分別配成MT-GAGs溶液10ml,取1ml分別上柱分離(Sephadex?G-751.6*30,流速5ml/分),214nm紫外監測,記錄儀顯示當MT-GAGs質量比為1∶0時有MT樣品吸收峰,質量比為1∶1~4∶1時在13~19份洗脫液有MT-GAGs樣品吸收峰,且隨MT量增大吸收峰值也增大,當比例增大到5∶1時另外又出現MT吸收峰,表示MT-GAGs配比達到飽和。?

5、MT-GAGs復合物經人工胃液作用后分離。?

取不同質量比MT-GAGs復合物適量,分別加人工胃液配制成1×10-4mol/LMT-GAGs溶液,37℃溫育120min,煮沸3分鐘酶滅火,8000r/min離心5min,取上清液用6000透析膜透析12小時,將透析后溶液轉入10ml容量瓶中,加水至刻度,再取1ml上柱分離(SephadexG-751.6*30,流速5ml/分),214nm紫外監測,記錄儀顯示當MT-GAGs質量比為1∶0時MT樣品無吸收峰,質量比為1∶1~4∶1時吸收峰與未經人工胃液處理樣品的吸收峰相同,在質量比>4∶1時吸收峰沒有大改變,過量的MT在人工胃液中被降解。?

6、結論。?

MT與GAGs最佳質量比為4~5∶1。?

二、MT-GAGs對鉛中毒小鼠的保護實驗:?

1、鉛中毒蓄積模型?

取小鼠每天灌胃40mg/L的醋酸鉛溶液,按0.01L/kg體重劑量灌胃,連續10天后,測定血鉛確定已中毒后,隨機分為染毒低劑量給藥組(LD)、染毒中劑量給藥組(MD)、染毒高劑量給藥組(HD)、染毒對照組(Pb)和正常對照組(NC),每組10只。?

2、樣品配制?

取MT-GAGs樣品分別配制成0.01%、0.05%和0.10%(mg/100ml)濃度樣品,105℃,保溫30分鐘,灌胃用。?

3、動物處理?

LD、MD、HD?3組每天灌胃不同濃度的MT-GAGs(MT∶GAGs=4.3∶1)樣品,Pb和NC組灌胃去離子水,按0.01L/kg體重劑量灌胃,連續7天,置代謝籠內,收集7天的尿和糞便。7天后眼眶取血,并處死動物,觀察內臟變化,分離腎臟及股骨,測定尿、糞及血、腎、骨的鉛含量。?

4、結果?

Pb組小鼠肉眼可見肝、腸明顯病變。其它各組小鼠內臟未見異常。染毒小鼠經用MT-GAGs灌胃后,3個濃度劑量組的小鼠的排泄鉛(尿鉛和糞鉛)均明顯高于未服MT-GAGs的Pb組染毒小鼠;血、腎、骨中的鉛含量明顯低于未服MT-GAGs的Pb組小鼠;HD、MD組的腎鉛和HD組的骨鉛接近于正常NC組,說明MT-GAGs能明顯增加體內鉛的排泄,降低體內鉛的蓄積,對鉛中毒小鼠具有與MT相同的保護作用。與單純MT實驗結果相同。?

三、MT-GAGs對熱的穩定性實驗:?

1、紅細胞懸液的制備:?

取新鮮兔肝素抗凝血2ml,2500r/min離心5min,吸掉血漿與白細胞,紅細胞用10倍PBS清洗后,2500r/min離心5min,棄掉上清液,重復清洗三次后,配成1×108紅細胞/ml懸液,備用。?

2、氯化汞濃度與溶血率的關系:?

測定Hg2+(汞離子)濃度0~2×10-4mol/L對兔血紅細胞溶血的影響。取以上配制的紅細胞懸液,吸取0.1ml,分別加入7.90ml不同濃度的HgCl2(氯化汞)溶液(Hg2+濃度0~2×10-4mol/L),輕搖后于37℃溫育30min,然后在3000r/min離心5min,取上清液測定417nm下的吸光值,按下式計算溶血率Hp:?

Hp=(A-A0)/(A∞-A0)?

式中:A0-不加HgCl2時上清液的吸光值?

A——加入一定HgCl2后對應的上清液吸光值?

A∞——HgCl2濃度大到紅細胞完全溶血時對應的吸光值?

從下表中可見隨Hg2+濃度增加,Hp%增大,當Hg2+濃度>37.5×10-6mol/L時,Hp%有突躍,大于56.3×10-6mol/L時,紅細胞全部溶血,試驗重復5次取平均值。?

3、MT對HgCl2引起的紅細胞溶血的抑制作用:?

取用NaCl調等滲后的1×10-6mol/L?MT一定量,加入到2.25×10-4mol/L?HgCl22ml溶液中,使MT與HgCl2濃度比達到一定值,用PBS調體積到7.9ml,混合均勻后,放置5min再加0.1ml紅細胞懸液,使總體積為8ml,輕搖后于37℃溫育30min,然后在3000r/min離心5min,取上清液測定417nm下的吸光值,每個濃度比分別以相應CMT濃度中不加HgCl2為空白對照管,試驗重復5次取平均值。A∞是不加MT紅細胞完全溶血時吸光值,計算溶血率減少的百分數HMT=1-A/A∞,以下數據可以看出隨體系中MT含量的增高,紅細胞溶血率減少的百分數HMT就增大。?

??CMT/CHgCl2×10-4 ??0 ??2.22 ??4.44 ??6.67 ??8.89 ??2.25×10-4mol/LHgCl2(ml) ??2 ??2 ??2 ??2 ??2

??1×10-6mol/L?Zn-MT(ml) ??0 ??0.10 ??0.20 ??0.30 ??0.40 ??PBS(ml) ??5.90 ??5.80 ??5.70 ??5.60 ??5.50 ??紅細胞懸液(ml) ??0.1 ??0.1 ??0.1 ??0.1 ??0.1 ??HMT ??/ ??39.2 ??52.1 ??63.6 ??77.7

4、MT與MT-GAGs在不同受熱時間對HgCl2引起的紅細胞溶血的抑制作用:?

取兩組2.25×10-4mol/L?HgCl22.0ml溶液,分別加入經105℃不同受熱時間處理后1×10-6mol/L的MT和MT-GAGs0.4ml,用NaCI調等滲,使MT和MT-GAGs與HgCl2摩爾濃度比達到8.89×10-4,用PBS調體積到7.9ml,混合均勻后,放置5min再加0.1ml紅細胞懸液,使總體積為8ml,輕搖后于37℃溫育30min,然后在3000r/min離心5min,取上清液測定417nm下的吸光值。計算溶血率減少的百分數HMT=1-A/A∞,以HMT≥77%為不溶血,HMT<77%為溶血。下表數據可以看出MT在105℃受熱3分鐘時可以保護紅細胞不發生溶血,受熱3分鐘以上紅細胞完全溶血;MT-GAGs在105℃受熱30分鐘時仍可以保護紅細胞不發生溶血,即MT在GAGs的保護下在105℃受熱30分鐘仍保留保護紅細胞抵抗汞離子產生溶血的活性。?

??受熱時間(105℃) ??3分鐘 ??5分鐘 ??10分鐘 ??20分鐘 ??30分鐘 ??1×10-6mol/LMT ??不溶血 ??溶血 ??溶血 ??溶血 ??溶血 ??1×10-6mol/L?MT-GAGs ??不溶血 ??不溶血 ??不溶血 ??不溶血 ??不溶血

關 鍵 詞:
蛋白 多糖 復合物
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
關于本文
本文標題:蛋白多糖復合物.pdf
鏈接地址:http://www.955770.tw/p-8278587.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
云南快乐10分怎么玩