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具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌及其構建方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201010224954.2

申請日:

20100709

公開號:

CN101914480A

公開日:

20101215

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:

IPC分類號:

C12N1/21,C12N15/53,C12N15/63,C02F1/58,C02F3/34,C12R1/19,C02F101/16

主分類號:

C12N1/21,C12N15/53,C12N15/63,C02F1/58,C02F3/34,C12R1/19,C02F101/16

申請人:

浙江大學

發明人:

閔航,呂鎮梅,趙詣

地址:

310027 浙江省杭州市西湖區浙大路38號

優先權:

CN201010224954A

專利代理機構:

杭州求是專利事務所有限公司

代理人:

陳昱彤

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內容摘要

本發明提供了一種具有亞硝酸鹽去除功能的非致病性工程菌及其構建方法。所述工程菌由重組質粒和宿主菌組成,重組質粒指的是連有nirS基因的重組pET載體,宿主菌指的是pET系統非致病性宿主菌。本發明是將含有cd1-NiRs的條件性致病菌中的nirS基因插入pET表達載體的多克隆位點處,將構建的重組質粒導入pET系統非致病性宿主菌中獲得重組菌株,培養重組菌株使nirS基因得到表達。本發明構建的非致病性工程菌對于水產養殖廢水中的亞硝酸鹽具有非常好的處理效果。該工程菌在對水產養殖廢水的處理中,無需加入IPTG進行誘導即可有很好的亞硝酸鹽去除效果,大大簡化了操作的步驟和處理的成本,具有重要的實際意義和廣闊的開發前景。

權利要求書

1.一種具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌,其特征在于:所述工程菌的保藏編號為CGMCC?No.3626;所述工程菌由重組質粒和宿主菌組成,重組質粒指的是連有nirS基因的重組pET載體,宿主菌指的是pET系統非致病性宿主菌。2.一種權利要求1所述的具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌的構建方法,包括如下步驟:1)按如下方法進行nirS基因的TA克?。涸O計nirS基因PCR反應擴增所需的引物,在上游引物和下游引物的5’端分別加入限制性酶切位點;以含有cd1-NiRs的條件性致病菌的基因組為模板,進行PCR反應擴增得到目的片段,該目的片段經純化后首先與T克隆載體進行連接,后再將連接產物轉入克隆宿主菌中挑取陽性克隆子進行測序以驗證目的片段是否得到正確擴增,對目的片段擴增正確的陽性克隆子進行雙酶切,回收目的片段;2)按以下方法構建連有nirS基因的重組PET表達載體:將步驟1)回收得到的目的片段首先與含有限制性酶切位點的pET表達載體進行連接,后將連接產物轉入克隆宿主菌中挑取陽性重組子,從所述陽性重組子中提取重組質粒,該重組質粒為連有nirS基因的重組PET表達載體;3)按以下方法構建所述非致病性工程菌:將步驟2)得到的重組質粒轉入pET系統非致病性宿主菌中,挑取陽性轉化子得到重組菌株,該重組菌株為所述非致病性工程菌。

說明書

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技術領域

本發明公開了一種具有亞硝酸鹽去除功能的非致病性工程菌及其構建方法,該工程菌可用于水產養殖水體中亞硝酸鹽的去除。

背景技術

水產養殖業是指水生環境系統中生物體的生產、加工和銷售,已有數千年的歷史。水產養殖是農業生產的重要組成部分,在過去50年中取得了迅猛發展。近年來,傳統的水產養殖業越來越趨向于集約化,在發展中存在的問題很多。在高投入、高產出的水產養殖系統中,殘留在水體中的排泄物及餌料殘渣遠遠超出了水體自身的凈化能力,導致大量氮元素滯留在養殖水體中。

氮元素在養殖水體中主要以分子態氮(N2)、氨氮(NH3、NH4+-N)、亞硝酸鹽(NO2--N)、硝酸鹽(NO3--N)及有機物氮(如尿素、氨基酸、蛋白質)等形式存在。養殖水體中的有機氮首先在氨化作用下轉化為氨氮。產生的氨氮在亞硝酸細菌的作用下轉化為亞硝酸鹽,隨后硝酸細菌將亞酸鹽轉化為硝酸鹽。最后再由反硝化細菌將硝酸鹽按亞硝酸鹽→一氧化氮→一氧化二氮-→氮氣的順序依次還原,完成水體氮循環過程。硝化過程中,亞硝酸細菌生長速率較快,較能適應不利的環境條件。而硝化細菌的生長較慢,易受環境條件的影響,因此當硝化細菌受到抑制時,有可能出現亞硝酸鹽(NO2-)的積累。在反硝化過程中,由于反硝化作用是一個生物耗能作用,而硝酸鹽還原酶所催化的NO3-→NO2-是整個過程的限速步驟,因此當環境中作為反硝化作用電子供體的能源物質不足時,就易使反硝化作用停滯于NO2-,從而導致亞硝酸鹽濃度的升高。由此可以看出,亞硝酸鹽作為硝化反應和反硝化反應過程中的產物,在水體氮循環過程中是不可避免的。

養殖水體中積累的亞硝酸鹽對于水產養殖動物具有強烈的毒性。當魚類發生亞硝酸鹽中毒時,其血液會變成棕色。研究表明,這是由于亞硝酸鹽氧化了生物體內血紅蛋白上的亞鐵離子所致。氧化生成的高鐵血紅蛋白失去了攜帶氧分子的能力,從而影響生物體內氧的運輸造成生物死亡。魏泰莉等發現鯽血液中的高鐵血紅蛋白隨亞硝酸鹽濃度的增加呈指數遞增關系;48h和96h毒性影響的臨界值分別為1.8mg/L和0.8mg/L[魏態莉,余瑞蘭,聶湘平,等.水中亞硝酸鹽對彭澤鯽血紅蛋白及高鐵血紅蛋白的影響.大連水產學報.2001.16(1):67-71.]。此外,亞硝酸鹽還能使生物體內的一些重要酶的活性降低,導致生物體代謝紊亂,生理功能失調等[吳中華,劉昌彬,劉存仁,等.中國對蝦慢性亞硝酸鹽和氨中毒的組織病理學研究.華中師范大學學報.1999.33(1):119-122.]。因此在水產養殖過程中,對亞硝酸鹽的防治應該是嚴格控制其在安全濃度以下。

目前用于水體中亞硝酸鹽去除的方法主要包括物理法、化學法及生物法?;钚蕴嘉椒?、離子交換法、滲透法等物理方法對于亞硝酸鹽具有較好的處理效果,但是處理成本較高,因而不適宜于大規模的水體處理?;瘜W法主要通過添加一些還原劑、氧化劑及螯合劑等將水體中的亞硝酸鹽去除?;瘜W法也存在著成本高的缺點,且還容易造成水體的二次污染。目前,生物方法是研究的重點和熱點,其主要利用可降解亞硝酸鹽的微生物或其產生的亞硝酸鹽還原酶,降低亞硝酸鹽含量。

目前報道的具有亞硝酸還原酶活性的微生物主要為反硝化細菌,包括假單胞菌屬、產堿桿菌、節桿菌(Arthrobacter?sp.)、糞產堿菌(Alcaligenesfaecalis)等。但許多反硝化細菌為條件性致病菌,對于水產養殖生物具有一定的危害性,不能直接用于水體的處理。因而亞硝酸還原酶編碼基因轉入非致病菌中構建具有亞硝酸鹽還原活性的非致病性工程菌株具有非常重要的意義。目前發現的亞硝酸還原酶有兩種,分別為血紅素cd1型亞硝酸還原酶(cd1-NiRs)和銅型亞硝酸還原酶(Cu-NiRs)。其中,cd1-NiRs由nirS基因編碼合成,而Cu-NiRs則由nirK基因編碼。2種亞硝酸還原酶的功能相同,每種反硝化細菌只具有1種類型的亞硝酸還原酶。含有cd1-NiRs的反硝化細菌包括施氏假單胞菌(Pseudomonas?stutxeri),銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)、泛養琉球菌(Thiosphaera?pantotropha)、渾球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)等。而糞產堿菌(Alcaligenes?faecalis)、裂環無色桿菌(Achromobacter?cycloclasters)、Pseudomonas?aureofacien中含有的亞硝酸還原酶則為Cu-NiRs。

發明內容

本發明的目的是提供一種具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌及其構建方法,該工程菌能夠用于水產養殖水體中亞硝酸鹽的去除。

為實現上述目的,本發明所采取的技術方案是:該具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌的保藏編號為CGMCC?No.3626;該工程菌由重組質粒和宿主菌組成,重組質粒指的是連有nirS基因的重組pET載體,宿主菌指的是pET系統非致病性宿主菌。

本發明的具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌的構建方法包括如下步驟:

1)按如下方法進行nirS基因的TA克?。?/p>

設計nirS基因PCR反應擴增所需的引物,在上游引物和下游引物的5’端分別加入限制性酶切位點;

以含有cd1-NiRs的條件性致病菌的基因組為模板,進行PCR反應擴增得到目的片段,該目的片段經純化后首先與T克隆載體進行連接,后再將連接產物轉入克隆宿主菌中挑取陽性克隆子進行測序以驗證目的片段是否得到正確擴增,對目的片段擴增正確的陽性克隆子進行雙酶切,回收目的片段。

2)按以下方法構建連有nirS基因的重組PET表達載體:

將步驟1)回收得到的目的片段首先與含有限制性酶切位點的pET表達載體進行連接,后將連接產物轉入克隆宿主菌中挑取陽性重組子,從所述陽性重組子中提取重組質粒,該重組質粒為連有nirS基因的重組PET表達載體。

3)按以下方法構建所述非致病性工程菌:

將步驟2)得到的重組質粒轉入pET系統非致病性宿主菌中,挑取陽性轉化子得到重組菌株,該重組菌株為所述非致病性工程菌。

本發明非致病性工程菌的分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia?coli),具有亞硝酸鹽去除能力,已于2010年2月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC),保藏編號為CGMCC?No.3626。

與現有技術相比,本發明的有益效果是:本發明提供一種新型的具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌,以該菌的亞硝酸鹽去除能力,可有效去除水產養殖廢水中的亞硝酸鹽。本發明的優點在于通過基因工程技術的方法將含有cd1-NiRs的條件性治病菌的nirS基因轉入pET系統非致病性宿主菌中,構建的非致病性工程菌能夠用于水產養殖廢水的處理。該工程菌在對水產養殖廢水的處理中,無需加入異丙基硫代-β-半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside,簡稱IPTG)進行誘導即可有很好的亞硝酸鹽去除效果,大大簡化了操作的步驟和處理的成本,具有重要的實際意義和廣闊的開發前景。

生物材料樣品的保藏信息:

保藏的生物材料樣品:大腸埃希氏菌ZY-4(Escherichia?coli?ZY-4);

保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱:CGMCC);

保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路1號院中國科學院微生物研究所

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保藏日期:2010年2月3日;

保藏登記號:CGMCC?No.3626。

附圖說明

圖1為表達載體pET-28a-c(+)的物理圖譜。

圖2為nirS基因的電泳檢測圖。

圖3為重組克隆載體pMD19-T-nirS的菌落PCR電泳檢測圖。

圖4為重組克隆載體pMD19-T-nirS的酶切鑒定結果。

圖5為重組表達載體pET-28a-nirS的菌落PCR電泳檢測圖。

圖6為重組表達載體pET-28a-nirS的酶切鑒定結果。

圖7為大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626的菌落PCR電泳檢測圖。

圖8為大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626的酶切鑒定結果。

圖9為大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626表達產物的SDS-PAGE電泳圖譜。

圖10為大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626的亞硝酸鹽去除能力測定結果。

圖11為大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626對模擬水產養殖廢水的處理效果。

圖12為大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626對實際水產養殖廢水的處理效果。

圖13為nirS基因的電泳檢測圖。

圖14為重組克隆載體pGEM-T-nirS的菌落PCR電泳檢測圖。

圖15為重組克隆載體pGEM-T-nirS的酶切鑒定結果。

圖16為重組表達載體pET-28a-nirS的菌落PCR電泳檢測圖。

圖17為重組表達載體pET-28a-nirS的酶切鑒定結果。

圖18為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21的菌落PCR電泳檢測圖。

圖19為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21的酶切鑒定結果。

圖20為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21表達產物的SDS-PAGE電泳圖。

圖21為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21的亞硝酸鹽去除能力測定結果。

圖22為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21對模擬水產養殖廢水的處理過程中氨氮(□)、亞硝酸鹽(*)、硝酸鹽(+)、及上清中總氮(■)的變化曲線。

圖23為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21對實際水產養殖廢水的處理過程中氨氮(□)、亞硝酸鹽(*)、硝酸鹽(+)、及上清中總氮(■)的變化曲線。

具體實施方式

本發明具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌的構建方法,是利用聚合酶鏈反應(Polymerase?Chain?Reaction,簡稱PCR)從含有cd1-NiRs的條件性致病菌中擴增得到nirS基因,將其進行TA克隆(Original?TA?Cloning?Kit)。挑取陽性克隆子測序,驗證目的片段是否得到正確擴增。對目的片段擴增正確的陽性克隆子進行雙酶切,回收目的片段。將目的片段連到pET表達載體中,所用的pET表達載體可從表1中選擇,例如,可選用pET-28a-c(+)【pET-28a-c(+)的物理圖譜如圖1所示】、pET-23a-d(+)或pET-24a-d(+)。將目的片段連到pET表達載體后得到重組質粒,即連有nirS基因的重組pET表達載體。將重組質粒轉入pET系統非致病性宿主菌中,所用pET系統非致病性宿主菌可從表2中選擇,例如,可選用大腸埃希式菌BL?21(簡稱E.coli?BL?21)、大腸埃希式菌BL21(DE3)(簡稱E.coli?BL21(DE3))或大腸埃希式菌BL21(DE3)pLysS(簡稱E.coli?BL21(DE3)pLysS)。接著,挑取陽性轉化子得到重組菌株,所得重組菌株即為本發明的具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌。本發明構建的具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌由重組質粒和宿主菌組成,其中,重組質粒指的是連有nirS基因的重組pET載體,宿主菌指的是pET系統非致病性宿主菌。本發明構建的具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌命名為大腸埃希式菌ZY-4(Escherichia?coli?ZY-4),已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,其保藏編號為CGMCC?No.3626。

具體地說,本發明具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌的構建過程為:

(1)nirS基因的TA克?。?/p>

根據基因庫(GenBank)中已報道的nirS基因開放閱讀框設計合成PCR所需的引物。為了便于定向克隆和載體構建,在上游引物和下游引物的5’端分別加入限制性內切酶位點。這兩個限制性酶切位點應該存在于pET表達載體上,而nirS基因中不應該具有這兩個酶切位點。

以含有cd1-NiRs的條件性致病菌的基因組(例如銅綠假單胞菌、斯氏假單胞菌等)為模板進行PCR反應擴增得到目的片段。目的片段經純化后首先與T克隆載體進行連接,連接產物轉入克隆宿主菌如大腸埃希氏菌DH5α(簡稱E.coli?DH5α)、JM109(簡稱E.coli?JM109)或NovaBlue中。采用菌落PCR及雙酶切方法對克隆子進行驗證。挑取陽性克隆子測序,驗證目的片段是否得到正確擴增。對目的片段擴增正確的陽性克隆子進行雙酶切,回收目的片段。

(2)連有nirS基因的重組PET表達載體的構建:

將回收得到的目的片段首先與pET表達載體如pET-28a-c(+)、pET-23a-d(+)、pET-24a-d(+)(可選擇的pET表達載體如表1所示)中進行連接,后將連接產物轉入克隆宿主菌如E.coli?DH5α、JM109或NovaBlue中。采用菌落PCR及雙酶切方法對重組子進行驗證,挑取陽性重組子。從陽性重組子中提取重組質粒,該重組質粒即為連有nirS基因的重組pET載體。

(3)亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌的構建

將重組質粒轉入pET系統非致病性宿主菌如E.coli?BL?21、E.coli?BL21(DE3)或E.coliBL21(DE3)pLysS(可選擇的pET非致病性宿主菌如表2所示)中,涂布含抗生素的牛肉膏蛋白胨培養基(Luria-Bertani,簡稱LB培養基)平板。采用菌落PCR及雙酶切方法篩選陽性轉化子,即可得到具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌。

上述含有cd1-NiRs的條件性致病菌如銅綠假單胞菌、斯氏假單胞菌等可從中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心購買得到。構建本發明具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌中所涉及到的T克隆載體、pET表達載體、E.coli?DH5α、JM109、NovaBlue、pET系統非致病性宿主菌、限制性內切酶和PCR所用的DNA聚合酶等均可從市場購得。

表1:構建本發明非致病性工程菌可選用的pET表達載體

注:I=內部標簽,N=N-端標簽,C=可選的C-端標簽;蛋白酶酶切位點:T=凝血酶,E=腸激酶,X=Xa因子

續表1

注:I=內部標簽,N=N-端標簽,C=可選的C-端標簽;蛋白酶酶切位點:T=凝血酶,E=腸激酶,X=Xa因子

表2:構建本發明非致病性工程菌可選用的pET系統非致病性宿主菌及其特性

續表2

續表2

續表2

實施例1

(一)nirS基因的TA克隆

1.以銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)為材料,采用十六烷基三乙基溴化銨(cetyltrimethylammonium?bromide,簡稱CTAB)法進行基因組DNA的提取。

2.引物設計

在GenBank已報道的銅綠假單胞菌中,銅綠假單胞菌PAO1(Pseudomonasaeruginosa?PAO1)、銅綠假單胞菌UCBPP-PA14(Pseudomonas?aeruginosaUCBPP-PA14)、銅綠假單胞菌LESB58(Pseudomonas?aeruginosa?LESB58)的nirS基因核苷酸序列的序列登錄號分別對應為AE004091.2、CP000438.1、FM209186.1),其中,Pseudomonas?aeruginosa?PAO1的nirS基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示,Pseudomonas?aeruginosa?UCBPP-PA14的nirS基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示,Pseudomonas?aeruginosa?LESB58的nirS基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

在本實施例中,可依據銅綠假單胞菌PAO1、銅綠假單胞菌UCBPP-PA14或銅綠假單胞菌LESB58的nirS基因核苷酸序列,應用Primer?premier?5.0軟件設計一對特異性引物nirS-1和nirS-2。為了便于定向克隆和載體構建,在上游引物nirS-1和下游引物nirS-2的5’端分別加入限制性內切酶位點。設計的上游引物nirS-1的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示,其中,畫線部分為加入的Nde?I酶切位點;設計的下游引物nirS-2的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示,其中,畫線部分為加入的EcoR?I酶切位點。該引物預計擴增得到的片段長度為1707bp。

設計的上游引物:ggaattccatatgatgccatttggcaagccactg

設計的下游引物:ccggaattctcagtacacgtcgtgctgggtg

3.nirS基因的PCR擴增

以銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)基因組為模板,通過PCR擴增目的片段。PCR反應體系(50uL)為:10×PCR緩沖液5.0uL,MgCl2(25mmol/L)4.0uL,dNTP?1.5uL,引物nirS-1和nirS-2各1.0uL,模板DNA?1.0uL,Taq酶(10000U/mL,由TaKaRa公司生產)0.5uL,重蒸水36.0uL。PCR反應程序為:94℃熱變性5min,然后94℃1min,58℃退火1min,72℃延伸1min50s,共35個循環,最后進行72℃延伸10min。反應結束,用瓊脂糖凝膠電泳分離檢測PCR產物。PCR反應結束后,采用1%的普通瓊脂糖電泳,檢查PCR產物,結果如圖2所示:圖2為nirS基因電泳檢測圖(泳道1為PCR產物,泳道M為DNA分子量標準),其中,泳道1在1707bp處有一條清晰條帶,所得結果與預期結果相符。

4.重組克隆載體pMD19-T-nirS的構建

PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后,采用AxyGEN公司的AxyPrep?PCRCleanup?Kit回收目的片段。將回收的目的片段克隆到pMD19-T?Vector上,進行藍白斑篩選。目的片段(割膠回收產物)與pMD19-vecter載體連接采用Takara公司的連接試劑盒。反應體系為(10uL):PCR回收產物4.5uL,pMD19-vecter?0.5uL,Solution?I?5uL。離心混勻,4℃放置16h(以上均在冰上操作)。取連接產物8uL加于100uL?E.coli?DH5α感受態細胞中,用移液槍吹打均勻,冰浴30min。42℃下熱激90s,立即放回冰浴中5min。加入LB液體1mL,混勻,37℃下200rpm培養1h,使細胞復蘇。取200uL轉化的細菌液涂布于含有50mg/ml氨芐(Ampicillin,簡稱Amp)的LB抗性平板上37℃下培養過夜進行篩選。

5.重組克隆載體pMD19-T-nirS的鑒定

挑取上述抗生素平板上的白色單菌落接入5mL含50mg/ml?Amp的LB液體培養基中,37℃、200rpm培養過夜。次日,直接以菌液為模板,M13-47為引物進行PCR擴增。PCR反應體系(50uL)為:10×PCR緩沖液5.0uL,MgCl2(25mmol/L)4.0μL,dNTP?1.5μL,M13-47通用引物各1.0μL,模板DNA?1.0μL,Taq酶(10000U/mL,TaKaRa公司)0.5μL,重蒸水36.0μL。PCR反應程序同上。反應結束,用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,結果如圖3所示:圖3為重組克隆載體pMD19-T-nirS的菌落PCR電泳檢測圖(泳道M為DNA分子量標準),泳道1、2在1707bp處未顯示出條帶,證明這兩個克隆子中未插入目的片段。而泳道3、4、5、6在1707bp處各有一條清晰條帶,初步證明這4個克隆子中插入了目的片段。

采用AxyGEN公司的AxyPrep?Plasmid?Miniprep?Kit對PCR檢測中初步證明插入目的片段的克隆子進行質粒提取。對質粒DNA作限制性內切酶雙酶切(Nde?I和EcoRI),酶切體系20uL,混合液置于37℃反應3h。反應結束后,對酶切產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳,觀察酶切片段的位置和大小。結果如圖4所示:圖4為重組克隆載體pMD19-T-nirS的酶切鑒定結果(泳道1為酶切產物,泳道M為DNA分子量標準),其中,泳道1在1707bp和2700bp處各有一條清晰條帶,分別對應于目的片段nirS和克隆載體pMD19-vecter,進一步證明這一克隆子中插入了目的片段。

PCR和酶切鑒定都正確的克隆子鑒定為陽性克隆子,命名為大腸埃希氏菌pMD19-T-nirS?DH5α。保存的甘油菌液采用Sanger雙脫氧鏈終止法或Maxam-Gilbert化學降解法進行測序,測序引物為M13-47。測序結果顯示陽性重組克隆載體中插入的目的片段序列如SEQ?ID?NO.3所示。將該序列通過NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)Blast程序與GenBank數據庫中的核苷酸序列進行比對。結果顯示,該序列與銅綠假單胞菌PAO1(Pseudomonasaeruginosa?PAO1)、銅綠假單胞菌UCBPP-PA14(Pseudomonas?aeruginosaUCBPP-PA14)、銅綠假單胞菌LESB58(Pseudomonas?aeruginosa?LESB58)的nirS基因核苷酸序列(序列登錄號分別為AE004091.2、CP000438.1、FM209186.1)(Pseudomonas?aeruginosa?PAO1的nirS基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示;Pseudomonas?aeruginosa?UCBPP-PA14的nirS基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示;Pseudomonas?aeruginosa?LESB58的nirS基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示)的相似性均達到100%。表明本發明重組克隆載體中所插入的目的片段含有正確的nirS基因序列,達到預期目的。

(二)重組表達載體pET-28a-nirS的構建

1、重組表達載體pET-28a-nirS的構建

采用AxyGEN公司的AxyPrep?Plasmid?Miniprep?Kit提取大腸埃希氏菌pMD19-T-nirS?DH5α的質粒DNA。然后采用限制性內切酶Nde?I和EcoR?I分別對質粒DNA和表達載體pET-28a-c(+)(購自Novagen生物公司)進行雙酶切。酶切體系20uL,混合液置于37℃反應3h。反應結束后,對酶切產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳。采用AxyGEN公司的AxyPrep?DNA?Gel?Extraction?Kit回收酶切產物。

采用T4?DNA連接酶將經雙酶切后割膠回收得到的目的片段與同樣經雙酶切處理的表達載體pET-28a-c(+)進行連接。反應體系10uL,混勻,16℃反應16h。取連接產物8uL加于100uL?E.coli?DH5α感受態細胞中,用移液槍吹打均勻,冰浴30min。42℃下熱激90s,立即放回冰浴中5min。加入LB液體1mL,混勻,37℃下200rpm培養1h,使細胞復蘇。取200uL轉化的細菌液涂布于含有50mg/L卡那霉素(Kanamycin,簡稱Kna)的LB抗性平板上37℃下培養過夜進行篩選。

2、重組表達載體pET-28a-nirS的鑒定

挑取上述抗生素平板上的單菌落接入5mL含50mg/L?Kna的LB液體培養基中,37℃、200rpm培養過夜。次日,直接以菌液為模板,T7為引物進行PCR擴增。PCR反應體系(50uL)為:10×PCR緩沖液5.0uL,MgCl2(25mmol/L)4.0μL,dNTP?1.5μL,T7通用引物各1.0μL,模板DNA?1.0μL,Taq酶(10000U/mL,TaKaRa公司)0.5μL,重蒸水36.0μL。PCR反應程序同上。反應結束,用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,結果如圖5所示:圖5為重組表達載體pET-28a-nirS的菌落PCR電泳檢測圖(泳道M為DNA分子量標準),泳道1、2、5、6、8在1707bp處無條帶,證明這5個重組子中未插入目的片段。而泳道3、4、7在1707bp處各有一條清晰條帶,初步證明這4個重組子中插入了nirS片段。

采用AxyGEN公司的AxyPrep?Plasmid?Miniprep?Kit對PCR檢測中初步證明插入目的片段的重組子進行質粒提取。對質粒DNA作限制性內切酶雙酶切(Nde?I和EcoRI),酶切體系20uL,混合液置于37℃反應3h。反應結束后,對酶切產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳,觀察酶切片段的位置和大小。結果如圖6所示,圖6為重組表達載體pET-28a-nirS的酶切鑒定結果,其中,泳道1、2、3、4為酶切產物,泳道M1、M2為DNA分子量標準,泳道1、2、3、4在1707bp和5000bp處各有一條清晰條帶,分別對應于目的片段nirS和表達載體pET-28a-c(+),進一步證明這四個重組子中插入目的片段,表達載體pET-28a-nirS構建成功。PCR和酶切鑒定都正確的重組子鑒定為陽性重組子,該陽性重組子被命名為:大腸埃希氏菌pET-28a-nirS?DH5α。

(三)重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21的構建

采用AxyGEN公司的AxyPrep?Plasmid?Miniprep?Kit提取大腸埃希氏菌pET-28a-nirS?DH5α的質粒DNA。取質粒DNA?8uL加于100uL?E.coli?BL?21感受態細胞中,用移液槍吹打均勻,冰浴30min。42℃下熱激90s,立即放回冰浴中5min。加入LB液體1mL,混勻,37℃下200rpm培養1h,使細胞復蘇。取200uL轉化的細菌液涂布于50mg/L含有Kna的LB抗性平板上37℃下培養過夜進行篩選。挑取抗生素平板上的單菌落接入5mL含50mg/L?Kna的LB液體培養基中,37℃、200rpm培養過夜。次日,采用上述相同的菌落PCR及酶切驗證方法鑒定陽性轉化子。圖7為大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626的菌落PCR電泳檢測圖(泳道M為DNA分子量標準)。圖7中,泳道1在1707bp處沒有出現條帶,說明該轉化子中未轉入重組表達載體pET-28a-nirS。而泳道2在1707bp出有一條清晰條帶,初步證明這個轉化子中轉入了重組表達載體pET-28a-nirS。圖8為大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626的酶切鑒定結果(泳道1為酶切產物,泳道M1、M2為DNA分子量標準)。圖8中,泳道1在1707bp和5000bp處各有一條清晰條帶,分別對應于目的片段nirS和表達載體pET-28a-c(+),進一步證明該轉化子中轉入了重組表達載體pET-28a-nirS。PCR和酶切結果都正確的轉化子鑒定為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21,即為本發明的大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626。

(四)nirS基因在大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626中表達的檢測

1、目的蛋白的誘導表達

從含有50mg/l?Kna的LB固體平板上挑取大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626菌落接入5mL含有50mg/L?Kna的LB液體培養基中,200rpm、37℃培養12-16h后,4℃靜置過夜,接入新鮮的50mg/L?Kna的LB培養基中,200rpm振蕩培養。當菌體生長至對數期時加入異丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.7mmol/L,然后繼續培養2.5h,離心收集菌體。裂解細胞后,以十二烷基磺酸納-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium?dodecyl?sulfate?polyacrylamide?gelelectrophoresis,簡稱SDS-PAGE)分析胞內總蛋白。

2、SDS-PAGE分析

將上述所提蛋白進行SDS-PAGE檢測,方法如下:

1)配制10%的分離膠,5%的濃縮膠;2)待測樣品于99℃加熱處理5min;3)各取20ul樣品上樣;4)起始電壓80V,待樣品跑過濃縮膠后,加壓至150V,溴酚蘭到達底部邊緣停止電泳;5)剝下膠塊,于10%三氯乙酸中固定1h;6)將膠塊置于0.05%卡馬斯亮藍染色液中染色過夜;7)用脫色液輕微震蕩脫色至背景干凈,條帶清晰。

結果如圖9所示:圖9大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626表達產物的SDS-PAGE電泳圖譜(泳道1為未誘導時的大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626蛋白,泳道2為誘導2h的大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626蛋白,泳道3為誘導4h的大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626蛋白,泳道M為蛋白電泳標準分子量),在泳道2和3中,在約65kDa附近處有一非常明顯的特異性蛋白條帶,其分子量大小與nirS基因分子量的理論預測值相符,說明nirS基因在大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626中得到了表達。

3、大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626的亞硝酸鹽去除能力測定

亞硝酸鹽去除能力測試培養基(g/L):NaNO2?0.097g,NH4Cl?0.246g,MgSO4·7H2O?0.039g,CaCl2?0.055g,FeSO4·7H2O?0.010g,CuSO4·5H2O?0.000024g,K2HPO413.908g,KH2PO45.304g,瓊脂20g(固體培養基中)。以上各化合物溶于1L蒸餾水中,用NaOH或HCl調節溶液pH值至7.0-7.5,分裝后滅菌。冷卻后在無菌條件下加入適量的滅菌葡萄糖母液,使得葡萄糖終濃度為3.96g/L。

將大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626接入含有50mg/L?Kna的LB液體培養基中,30℃振蕩培養過夜。菌株生長至對數期時,取出適量菌液,12000rpm離心5min,收集菌體。從每個管中取出適量菌液,12000rpm離心5min,收集菌體。用無菌水清洗3次后再離心收集菌體。取適量菌體接入100mL亞硝酸鹽去除能力測試培養基中,使OD600=0.9左右。同時在培養基內加入異丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)至濃度0.7mmol/L進行誘導,200rpm、37℃培養16h。每隔1h取樣,測定樣品中亞硝酸鹽含量。亞硝酸鹽含量測試方法為N-(1-萘基)-乙二胺光度法(參見:國家環境保護總局,《水和廢水監測分析方法》編委會編(2002),水和廢水監測分析方法(第四版),中國環境科學出版社)。

本測試中設置5個對照組,對照1為野生菌株Pseudomonas?aeruginosa,對照2為未加入IPTG誘導的大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626,對照3為含有空的載體質粒pET-28a?E.coli?BL?21菌株,對照4為不攜帶質粒的表達宿主菌株E.coli?BL?21,對照5不投加任何菌體。分別測試了上述5個對照組的亞硝酸鹽去除效果,測試方法與上述基本相同,不同之處培養基中不用加入IPTG進行誘導。此外,除未加入IPTG誘導的大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626及含有空的載體質粒pET-28aE.coli?BL?21菌株的培養基中要加入Kna至終濃度50mg/L外,其他菌株的培養基中均不用加入Kna。

測定結果如圖10所示:圖10為大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626的亞硝酸鹽去除能力測定結果(圖10中,■為誘導的大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626樣品中亞硝酸鹽含量變化曲線,◇為未誘導的大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626樣品中亞硝酸鹽含量變化曲線,*為野生菌株樣品中亞硝酸鹽含量變化曲線,▲為未插入目標片段的表達宿主菌BL?21樣品中亞硝酸鹽含量變化曲線,+為未投加菌株的樣品中亞硝酸鹽含量變化曲線)可以看出,誘導的大腸埃希氏菌CGMCCNo.3626、未誘導的大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626樣品中亞硝酸鹽含量均大幅度的下降。表明誘導的大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626、未誘導的大腸埃希氏菌CGMCCNo.3626具有非常好的亞硝酸鹽去除能力。

(五)大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626對實際水產養殖廢水及模擬水產養殖廢水的處理效果

1)將大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626菌株活化;2)將活化后的菌株接入含有卡那霉素的LB液體培養基中,30℃振蕩培養過夜;3)從管中取出適量菌液,12000rpm離心5min,收集菌體。用無菌水清洗3次后重懸。將菌株懸液接入100mL實際及模擬的水產養殖廢水中,使OD600=0.9左右;4)每隔1h取樣,測定樣品中亞硝酸鹽、氨氮、硝酸鹽含量及上清中總氮含量。所有樣品均設置3個重復,以不接菌的培養基為空白對照。

實際水產養殖廢水中氨氮含量為4.517mg/L,亞硝酸鹽含量為1.126mg/L,硝酸鹽含量為9.016mg/L,總氮含量為19.145mg/L。外源添加葡萄糖調整高錳酸鉀指數(potassium?permanganate?index,簡稱CODMn)至80mg/L左右,加入IPTG至濃度0.7mmol/L。

模擬水產養殖廢水中含有的氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽,總氮含量為實際水產養殖廢水的4倍左右,具體為氨氮16.817mg/L、亞硝酸鹽5.018mg/L、硝酸鹽46.167mg/L,總氮73.817mg/L。外源添加添加葡萄糖調整CODMn至320mg/L左右,加入IPTG至濃度0.7mmol/L。

結果見圖11、12所示,圖11為大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626對模擬水產養殖廢水的處理過程中氨氮(□)、亞硝酸鹽(*)、硝酸鹽(+)、及上清中總氮(■)含量的變化曲線,圖12為大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626對實際水產養殖廢水的處理過程中氨氮(□)、亞硝酸鹽(*)、硝酸鹽(+)、及上清中總氮(■)含量的變化曲線??梢钥闯?,投放了大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626的養殖水體中亞硝酸鹽濃度呈下降趨勢,說明大腸埃希氏菌CGMCC?No.3626對含有高濃度亞硝酸鹽的模擬和實際水產養殖廢水具有較好的處理效果。

實施例2

(一)nirS基因的TA克隆

1.以施氏假單胞菌(Pseudomonas?stutzeri)為材料,采用CTAB法進行基因組DNA的提取。

2.引物設計

依據GenBank中已報道的施氏假單胞菌A151(Pseudomonas?stutzeri?A151)或施氏假單胞菌LYS-86(Pseudomonas?stutzeri?LYS-86)的nirS基因核苷酸序列(序列登錄號分別為AY957388.1和GU474546.1)(Pseudomonas?stutzeriA151的nirS基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7所示;Pseudomonas?stutzeri?LYS-86的nirS基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.8所示),應用Primer?premier?5.0軟件設計一對特異性引物。為了便于定向克隆和載體構建,在上游引物和下游引物的5’端分別加入限制性內切酶位點。設計的上游引物nirS-1的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.9所示,其中,畫線部分為加入的Nde?I酶切位點;設計的下游引物nirS-2的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.10所示,其中,畫線部分為加入的BamHI酶切位點。該引物預計擴增得到的片段長度為257bp。

設計的上游引物:ggaattccatatgcgcctggagaacatcattgc

設計的下游引物:cgcggatcccttcagtgtcttgtcgtcat

3.nirS基因的PCR擴增

以施氏假單胞菌(Pseudomonas?stutzeri)基因組為模板,通過PCR擴增目的片段。PCR反應體系(50uL)為:10×PCR緩沖液5.0uL,MgCl2(25mmol/L)4.0uL,dNTP?1.5uL,引物nirS-1和nirS-2各1.0uL,模板DNA?1.0uL,Taq酶(10000U/mL,TaKaRa公司)0.5uL,重蒸水36.0uL。PCR反應程序為:94℃熱變性5min,然后94℃1min,58℃退火1min,72℃延伸1min50s,共35個循環,最后進行72℃延伸10min。反應結束,用瓊脂糖凝膠電泳分離檢測PCR產物。PCR反應結束后,采用1%的普通瓊脂糖電泳,檢查PCR產物,結果如圖13所示:圖13為nirS基因電泳檢測圖(泳道1為PCR產物,泳道M為DNA分子量標準)泳道1在257bp處有一條清晰條帶,所得結果與預期結果相符。

4.重組克隆載體pMD8-T-nirS的構建

PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后,采用AxyGEN公司的AxyPrep?PCRCleanup?Kit回收目的片段。將回收的目的片段克隆到pGEM-T?Vector上,進行藍白斑篩選。目的片段(割膠回收產物)與pGEM-vecter載體連接采用Takara公司的連接試劑盒。反應體系為(10uL):PCR回收產物4.5uL,pGEM-vecter?0.5uL,Solution?I?5uL。離心混勻,4℃放置16h(以上均在冰上操作)。取連接產物8uL加于100uL?E.coli?JM109感受態細胞中,用移液槍吹打均勻,冰浴30min。42℃下熱激90s,立即放回冰浴中5min。加入LB液體1mL,混勻,37℃下200rpm培養1h,使細胞復蘇。取200uL轉化的細菌液涂布于含有50mg/ml氨芐(Ampicillin,簡稱Amp)的LB抗性平板上37℃下培養過夜進行篩選。

5.重組克隆載體pGEM-T-nirS的鑒定

挑取上述抗生素平板上的白色單菌落接入5mL含50mg/ml?Amp的LB液體培養基中,37℃、200rpm培養過夜。次日,直接以菌液為模板,M13/pUC(-29)back和M13/pUC(40)for為引物進行PCR擴增。PCR反應體系(50uL)為:10×PCR緩沖液5.0uL,MgCl2(25mmol/L)4.0μL,dNTP?1.5μL,M13/pUC(-29)back和M13/pUC(40)for引物各1.0μL,模板DNA?1.0μL,Taq酶(10000U/mL,TaKaRa公司)0.5μL,重蒸水36.0μL。PCR反應程序同上。反應結束,用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,結果如圖14所示:圖14為重組克隆載體pGEM-T-nirS的菌落PCR電泳檢測圖(泳道M為DNA分子量標準)泳道1、2在257bp處未顯示出條帶,證明這兩個克隆子中未插入目的片段。而泳道3、4、5、6在257bp處各有一條清晰條帶,初步證明這4個克隆子中插入了目的片段。

采用AxyGEN公司的AxyPrep?Plasmid?Miniprep?Kit對PCR檢測中初步證明插入目的片段的克隆子進行質粒提取。對質粒DNA作限制性內切酶雙酶切(Nde?I和BamHI),酶切體系20uL,混合液置于37℃反應3h。反應結束后,對酶切產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳,觀察酶切片段的位置和大小。結果如圖15所示:圖15為重組克隆載體pGEM-T-nirS的酶切鑒定結果(泳道1為酶切產物,泳道M為DNA分子量標準)泳道1在257bp和2692bp處各有一條清晰條帶,分別對應于目的片段nirS和克隆載體pGEM-T?vecter,進一步證明這一克隆子中插入了目的片段。

PCR和酶切鑒定都正確的克隆子鑒定為陽性克隆子,命名為大腸埃希氏菌pGEM-T-nirS?JM109。保存的甘油菌液采用Sanger雙脫氧鏈終止法或Maxam-Gilbert化學降解法進行測序,測序引物為M13-47。測序結果顯示重組克隆載體中插入的目的片段序列如SEQ?ID?NO.11所示。將該序列通過NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)Blast程序與GenBank數據庫中的核苷酸序列進行比對。結果顯示,該序列與施氏假單胞菌A151(Pseudomonas?stutzeriA151)、施氏假單胞菌LYS-86(Pseudomonas?stutzeri?LYS-86)的nirS基因核苷酸序列(序列登錄號分別為AY957388.1和GU474546.1)的相似性均為100%(AY957388.1的nirS基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7所示;GU474546.1的nirS基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.8所示)。表明重組克隆載體中所插入的目的片段含有正確的nirS基因序列,達到預期目的。

(二)重組表達載體pET-28a-nirS的構建

1、重組表達載體pET-28a-nirS的構建

采用AxyGEN公司的AxyPrep?Plasmid?Miniprep?Kit提取大腸埃希氏菌pGEM-T-nirS?JM109的質粒DNA。然后采用限制性內切酶Nde?I和BamHI分別對質粒DNA和表達載體pET-28a-c(+)(購自Novagen生物公司)進行雙酶切。酶切體系20uL,混合液置于37℃反應3h。反應結束后,對酶切產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳。采用AxyGEN公司的AxyPrep?DNA?Gel?Extraction?Kit回收酶切產物。

采用T4?DNA連接酶將經雙酶切后割膠回收得到的目的片段與同樣經雙酶切處理的表達載體pET-28a-c(+)進行連接。反應體系10uL,混勻,16℃反應16h。取連接產物8uL加于100uL?E.coli?JM109感受態細胞中,用移液槍吹打均勻,冰浴30min。42℃下熱激90s,立即放回冰浴中5min。加入LB液體1mL,混勻,37℃下200rpm培養1h,使細胞復蘇。取200uL轉化的細菌液涂布于含有50mg/L?Kna的LB抗性平板上37℃下培養過夜進行篩選。

2、重組表達載體pET-28a-nirS的鑒定

挑取上述抗生素平板上的單菌落接入5mL含50mg/L?Kna的LB液體培養基中,37℃、200rpm培養過夜。次日,直接以菌液為模板,T7為引物進行PCR擴增。PCR反應體系(50uL)為:10×PCR緩沖液5.0uL,MgCl2(25mmol/L)4.0μL,dNTP?1.5μL,T7通用引物各1.0μL,模板DNA?1.0μL,Taq酶(10000U/mL,TaKaRa公司)0.5μL,重蒸水36.0μL。PCR反應程序同上。反應結束,用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,結果如圖16所示:圖16為重組表達載體pET-28a-nirS的菌落PCR電泳檢測圖(泳道M為DNA分子量標準)泳道1、3、6、8在257bp處無條帶,證明這4個重組子中未插入目的片段。而泳道2、4、5、7在257bp處各有一條清晰條帶,初步證明這4個重組子中插入了nirS片段。

采用AxyGEN公司的AxyPrep?Plasmid?Miniprep?Kit對PCR檢測中初步證明插入目的片段的重組子進行質粒提取。對質粒DNA作限制性內切酶雙酶切(Nde?I和BamHI),酶切體系20uL,混合液置于37℃反應3h。反應結束后,對酶切產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳,觀察酶切片段的位置和大小。結果如圖17所示:圖17為重組表達載體pET-28a-nirS的酶切鑒定結果(泳道1、2為酶切產物,泳道M1、M2為DNA分子量標準)泳道2在257bp和5000bp處各有一條清晰條帶,分別對應于目的片段nirS和表達載體pET-28a-c(+),進一步證明這個重組子中插入目的片段,表達載體pET-28a-nirS構建成功。PCR和酶切鑒定都正確的重組子鑒定為陽性重組子,命名為:大腸埃希氏菌pET-28a-nirSJM109。

(三)重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21的構建

采用AxyGEN公司的AxyPrep?Plasmid?Miniprep?Kit提取大腸埃希氏菌pET-28a-nirS?JM109的質粒DNA。取質粒DNA?8uL加于100uL?E.coli?BL?21感受態細胞中,用移液槍吹打均勻,冰浴30min。42℃下熱激90s,立即放回冰浴中5min。加入LB液體1mL,混勻,37℃下200rpm培養1h,使細胞復蘇。取200uL轉化的細菌液涂布于50mg/L含有Kna的LB抗性平板上37℃下培養過夜進行篩選。挑取抗生素平板上的單菌落接入5mL含50mg/L?Kna的LB液體培養基中,37℃、200rpm培養過夜。次日,采用上述相同的菌落PCR及酶切驗證方法鑒定陽性轉化子。圖18為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coliBL?21的菌落PCR電泳檢測圖(泳道M為DNA分子量標準)。泳道7在257bp出沒有出現條帶,說明該轉化子中未轉入重組表達載體pET-28a-nirS。而泳道1、2、3、4、5、6在257bp出有一條清晰條帶,初步證明這6個轉化子中轉入了重組表達載體pET-28a-nirS。圖19為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL21的酶切鑒定結果(泳道1、2為酶切產物,泳道M1、M2為DNA分子量標準)。泳道1在257bp和5000bp處各有一條清晰條帶,分別對應于目的片段nirS和表達載體pET-28a-c(+),進一步證明該轉化子中轉入了重組表達載體pET-28a-nirS。PCR和酶切結果都正確的轉化子鑒定重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21,即具有亞硝酸鹽去除功能的非致病性工程菌。

(四)nirS基因在E.coli?BL?21中表達的檢測

1、目的蛋白的誘導表達

從含有50mg/l?Kna的LB固體平板上挑取重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21菌落接入5mL含有50mg/L?Kna的LB液體培養基中,200rpm、37℃培養12-16h后,4℃靜置過夜,接入新鮮的50mg/L?Kna的LB培養基中,200rpm振蕩培養。當菌體生長至對數期時加入IPTG至終濃度為0.7mmol/L,然后繼續培養2.5h,離心收集菌體。裂解細胞后,以SDS-PAGE分析胞內總蛋白。

2、SDS-PAGE分析

將上述所提蛋白進行SDS-PAGE檢測,方法如下:

1)配制10%的分離膠,5%的濃縮膠;2)待測樣品于99℃加熱處理5min;3)各取20ul樣品上樣;4)起始電壓80V,待樣品跑過濃縮膠后,加壓至150V,溴酚蘭到達底部邊緣停止電泳;5)剝下膠塊,于10%三氯乙酸中固定1h;6)將膠塊置于0.05%卡馬斯亮藍染色液中染色過夜;7)用脫色液輕微震蕩脫色至背景干凈,條帶清晰。

結果如圖20所示:圖20為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21表達產物的SDS-PAGE電泳圖(泳道1為未誘導時的重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21蛋白,泳道2為誘導2h的重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21蛋白,泳道3為誘導4h的重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21蛋白,泳道M為蛋白電泳標準分子量)泳道2和3中,在約58kDa附近處有一非常明顯的特異性蛋白條帶,其分子量大小與nirS基因分子量的理論預測值相符,說明nirS基因在重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21中的到了表達。

3、重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21的亞硝酸鹽去除能力測定

亞硝酸鹽去除能力測試培養基(g/L):NaNO2?0.097g,NH4Cl?0.246g,MgSO4·7H2O?0.039g,CaCl2?0.055g,FeSO4·7H2O?0.010g,CuSO4·5H2O?0.000024g,K2HP04?13.908g,KH2PO4?5.304g,瓊脂20g(固體培養基中)。以上各化合物溶于1L蒸餾水中,用NaOH或HCl調節溶液pH值至7.0-7.5,分裝后滅菌。冷卻后在無菌條件下加入適量的滅菌葡萄糖母液,使得葡萄糖終濃度為3.96g/L。

將重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21接入含有50mg/L?Kna的LB液體培養基中,30℃振蕩培養過夜。菌株生長至對數期時,取出適量菌液,12000rpm離心5min,收集菌體。從每個管中取出適量菌液,12000rpm離心5min,收集菌體。用無菌水清洗3次后再離心收集菌體。取適量菌體接入100mL亞硝酸鹽去除能力測試培養基中,使OD600=0.9左右。同時在培養基內加入IPTG至濃度0.7mmol/L進行誘導,200rpm、37℃培養16h。每隔1h取樣,測定樣品中亞硝酸鹽含量。亞硝酸鹽含量測試方法為N-(1-萘基)-乙二胺光度法(國家環境保護總局,《水和廢水監測分析方法》編委會編(2002),水和廢水監測分析方法(第四版),中國環境科學出版社)。

本測試中設置5個對照組,對照1為施氏假單胞菌(Pseudomonas?stutzeri),對照2為未加入IPTG誘導的重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21,對照3為含有空的載體質粒pET-28a(+)E.coli?BL?21菌株,對照4為不攜帶質粒的表達宿主菌株E.coli?BL?21,對照5不投加任何菌體。分別測試了上述5個對照組的亞硝酸鹽去除效果,測試方法與上述基本相同,不同之處培養基中不用加入IPTG進行誘導。此外,除未加入IPTG誘導的重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21及含有空的載體質粒pET-28a(+)E.coli?BL?21菌株的培養基中要加入Kna至終濃度50mg/L外,其他菌株的培養基中均不用加入Kna。

測定結果如圖21所示:圖21為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL21的亞硝酸鹽去除能力測定結果(■為誘導的重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21樣品中亞硝酸鹽含量變化曲線,◇為未誘導的重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21樣品中亞硝酸鹽含量變化曲線,*為施氏假單胞菌樣品中亞硝酸鹽含量變化曲線,▲為未插入目標片段的表達宿主菌BL?21樣品中亞硝酸鹽含量變化曲線,-為未投加菌株樣品中亞硝酸鹽含量變化曲線)可以看出,誘導的重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21、未誘導的重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21均表現出非常好的亞硝酸鹽去除能力。

(五)重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E?coli?BL?21對實際水產養殖廢水及模擬水產養殖廢水的處理效果

1)將重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21菌株活化;2)將活化后的菌株接入含有卡那霉素的LB液體培養基中,30℃振蕩培養過夜;3)從管中取出適量菌液,12000rpm離心5min,收集菌體。用無菌水清洗3次后重懸。將菌株懸液接入100mL實際及模擬的水產養殖廢水中,使OD600=0.9左右;4)每隔1h取樣,測定樣品中亞硝酸鹽、氨氮、硝酸鹽含量及上清中總氮含量。所有樣品均設置3個重復,以不接菌的培養基為空白對照。

實際水產養殖廢水中氨氮含量為4.517mg/L,亞硝酸鹽含量為1.126mg/L,硝酸鹽含量為9.016mg/L,總氮含量為19.145mg/L。外源添加葡萄糖調整高錳酸鉀指數(potassium?permanganate?index,簡稱CODMn)至80mg/L左右,加入IPTG至濃度0.7mmol/L。

模擬水產養殖廢水中含有的氨氮,亞硝酸鹽,硝酸鹽,總氮含量為實際水產養殖廢水的4倍左右,具體為氨氮16.817mg/L,亞硝酸鹽5.018mg/L,硝酸鹽46.167mg/L,總氮73.817mg/L。外源添加添加葡萄糖調整CODMn至320mg/L左右,加入IPTG至濃度0.7mmol/L。

結果見圖22、23所示,圖22為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL21對模擬水產養殖廢水的處理過程中氨氮(□)、亞硝酸鹽(*)、硝酸鹽(+)、及上清中總氮(■)含量的變化曲線,圖23為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21對實際水產養殖廢水的處理過程中氨氮(□)、亞硝酸鹽(*)、硝酸鹽(+)、及上清中總氮(■)含量的變化曲線??梢钥闯?,投放了重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21的養殖水體中亞硝酸鹽濃度呈下降趨勢,說明重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli?BL?21對含有高濃度亞硝酸鹽的模擬和實際水產養殖廢水具有較好的處理效果。

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