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一種固定化漆酶及其制備方法和應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201010228187.2

申請日:

20100708

公開號:

CN101914515A

公開日:

20101215

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:

IPC分類號:

C12N11/02,C02F3/34,C02F101/36,C02F103/28,C02F103/36

主分類號:

C12N11/02,C02F3/34,C02F101/36,C02F103/28,C02F103/36

申請人:

北京歐凱納斯科技有限公司

發明人:

劉迎春,高源

地址:

100094 北京市海淀區北清路103號

優先權:

CN201010228187A

專利代理機構:

北京路浩知識產權代理有限公司

代理人:

張慶敏;王朋飛

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內容摘要

本發明公開了一種固定化漆酶,其是以螯合樹脂為載體,將漆酶通過吸附、螯合作用固定在該載體上,所述螯合樹脂的結構中鍵合有含羧基的活性功能基團。本發明的固定化漆酶能夠應用于含酚類污染物的污水處理中,具有加工工藝簡單,成本低廉,漆酶吸附率高,漆酶活性損失小,性質穩定等特點。

權利要求書

1.一種固定化漆酶,其特征在于,其是以螯合樹脂為載體,將漆酶通過吸附、螯合作用固定在該載體上,所述螯合樹脂的結構中鍵合有含羧基的活性功能基團。2.如權利要求1所述的固定化漆酶,其特征在于,所述螯合樹脂為亞氨基羧酸型螯合樹脂和三元含羧基氯醋樹脂。3.一種固定化漆酶的制備方法,其特征在于,將經過乙醇處理后的螯合樹脂經干燥后放入含漆酶的緩沖液中,震蕩吸附即得固定化漆酶,其中所述螯合樹脂的結構中鍵合有含羧基的活性功能基團。4.如權利要求3所述的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:(1)將螯合樹脂在乙醇中浸泡3-5h,濾去乙醇后,真空干燥;(2)將干燥后的樹脂放入含漆酶的pH8.0磷酸緩沖液中,3-5℃下震蕩吸附6-12h;(3)用磷酸緩沖溶液洗滌,直到洗滌液中沒有蛋白被檢出。5.權利要求1或2所述的固定化漆酶在含酚類污染物的污水處理中的應用。6.如權利要求5所述的應用,其特征在于,所述含酚類污染物的污水為造紙廢水或工業染料廢水。

說明書

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技術領域

本發明涉及酶的固定化技術領域,具體是涉及一種用螯合樹脂固定化漆酶及其制備方法和在污水處理方面的應用。

背景技術

漆酶(Laccases)是一種結合多個銅離子的蛋白質,屬于藍色多銅氧化酶家族,廣泛存在于植物、真菌甚至昆蟲體內。漆酶可存活于空氣中,能夠催化包括酚及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及其衍生物、甾體激素和生物色素、金屬有機化合物、非酚類底物等一系列底物的氧化反應,反應后唯一的產物就是水,是一種綠色,環保,作用條件溫和的生物催化劑,在生物造紙、食品生產、環境污染治理、有機合成、生物及免疫檢測等方面具有很強的應用潛力。因此,國內外對漆酶的研究已在生物、化學、物理、醫學等多領域,分子、細胞、生物組織等多水平全面展開。

漆酶蛋白一般由500-550個氨基酸構成,含19種氨基酸,不同來源的漆酶其氨基酸序列相似性并不高,最大的共性是含有4個銅離子的活性結構中心,和銅原子連接的cys和His及其周圍的氨基酸殘基是保守的,這些氨基酸都分布在含有兩對His的N末端區域,或是分布于C末端的Cys和其余結合銅離子的His之間。研究表明,目前提高漆酶酶活效果最好的金屬離子主要是銅離子。

固定化酶技術,就是將生物酶通過化學或物理的處理方法固定在固體載體上,使原來水溶性的酶與固態的水不溶載體相結合,用于溶液中的酶促反應,反應完成后通過簡單過濾即可與反應體系分離,并可以多次重復利用,降低生產成本。20世紀60年代后,固定化酶技術的研究得到了蓬勃的發展,到目前為止,已研究開發了多種固定化方法,包括吸附法、鍵合法、交聯法和包埋法,各自優缺點如表1所示。

表1酶的幾種不同固載方法的比較

固定化漆酶技術以鍵合法和交聯法研究最為廣泛,為漆酶的廣泛應用提供了重要的理論依據,但是現有的漆酶固定化方法和載體普遍存在著固定化效率低、加工工藝復雜、生產成本高、性質不穩定等缺陷,很難工業生產并實際應用。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足,提供一種利用螯合樹脂固定化漆酶的方法及產品。

本發明的進一步目的在于提供上述固定化漆酶在污水處理方面的應用。

本發明所提供的固定化漆酶是以螯合樹脂為載體,將漆酶通過吸附、螯合作用固定在該載體上。所述的螯合樹脂,其結構中鍵合有含羧基的活性功能基團。其原理如圖1所示,利用螯合樹脂上的羧基基團與漆酶蛋白中的胺基之間的靜電作用,將漆酶蛋白固定到樹脂上后,漆酶蛋白中的4個銅原子會進一步與羧基基團配位螯合,從而使漆酶更加穩定的固定在螯合樹脂上。

其中,所述的螯合樹脂,其結構中鍵合有含羧基的活性功能基團,可以為市售商品也可以通過常規方法修飾得到,優選為亞氨基羧酸型螯合樹脂和三元含羧基氯醋樹脂。本發明所提供的固定化漆酶的制備方法如下:

(1)將螯合樹脂在乙醇中浸泡3-5h,濾去乙醇后,真空干燥;

(2)將干燥后的樹脂放入含漆酶的磷酸緩沖液中(pH=8.0),3-5℃下震蕩吸附6-12h;其中大約每1g樹脂需要200U-500U的漆酶;

(3)用pH=8.0的磷酸緩沖溶液洗滌,并檢測洗滌液,直到洗滌液中沒有蛋白檢出。

本發明所提供的固定化漆酶可以應用于含酚類污染物的污水處理,例如造紙廢水和工業染料廢水,實驗表明,本發明所提供的固定化漆酶2h內對2,4,6-三氯酚的去除率在98%以上。

本發明的優點和有益效果在于:(1)本發明提供的固定化漆酶,加工工藝簡單,成本低廉;(2)本發明提供的固定化方法,漆酶的吸附率高,可以達到90%以上;(3)本發明提供的固定化漆酶,活性損失小,催化效率很高,性質穩定,可重復使用;(4)本發明通過靜電和螯合雙重作用吸附固定漆酶,比傳統的離子交換吸附法吸附更加牢固,受溫度和pH影響??;(5)本發明提供的固定化漆酶,一旦漆酶的活性降低后還可以再生,避免了載體的浪費。

附圖說明

圖1為金屬螯合樹脂固定化漆酶原理示意圖;

圖2為固定化漆酶的操作穩定性試驗結果。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例,對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明,但不用來限制本發明的范圍。

實施例1亞氨基羧酸型螯合樹脂固定化漆酶的制備

(1)將10g市售亞氨基羧酸型螯合樹脂(型號LSC-100)在500ml乙醇中浸泡4h,濾去乙醇后,真空干燥4h;

(2)將干燥后的樹脂放入500ml含3000U漆酶的磷酸緩沖液中(pH=8.0),4℃下震蕩吸附6-12h;

(3)用pH=8.0的磷酸緩沖溶液洗滌,并檢測洗滌液,直到洗滌液中沒有蛋白檢出。

(4)利用考馬斯亮藍染色法(Bradford法)分別測定固定前加入的漆酶量M1和固定后洗出液中剩余的漆酶量M2,計算出漆酶的固定化率:漆酶的固定化率=[(M1-M2)/M1]×100%。漆酶的固定化率為92%。

實施例2三元含羧基氯醋樹脂固定化漆酶的制備

(1)將10g市售三元含羧基氯醋樹脂(型號C42)在500ml乙醇中浸泡4h,濾去乙醇后,真空干燥4h;

(2)將干燥后的樹脂放入500ml含5000U漆酶的磷酸緩沖液中(pH=8.0),4℃下震蕩吸附6-12h;

(3)用pH=8.0的磷酸緩沖溶液洗滌,并檢測洗滌液,直到洗滌液中沒有蛋白檢出。

(4)利用考馬斯亮藍染色法(Bradford法)分別測定固定前加入的漆酶量M1和固定后洗出液中剩余的漆酶量M2,計算出漆酶的固定化率:漆酶的固定化率=[(M1-M2)/M1]×100%。漆酶的固定化率為86%。

實施例3固定化漆酶的熱穩定性

分別將實施例1中的固定化漆酶和游離漆酶置于70℃水浴中保溫,定時取樣檢測其氧化愈創木酚的活性,結果表明游離酶在70℃水浴中保溫1h后,酶活力明顯下降,4h后酶活損失達到99%以上。而固定化漆酶在相同條件下保溫4h酶活僅損失19%,8h時仍保留酶活56.5%,顯示酶經固定化后其熱穩定性得到明顯提高。實施例2的固定化漆酶與此類似。

實施例4固定化漆酶的pH穩定性

取適量的實施例1中的固定化漆酶,分別懸浮于pH值不同的磷酸緩沖液中,25℃保溫,每隔一段時間取出測定酶活性。結果表明,在pH?4.0~9.0范圍內,固定化漆酶有較好的穩定性;當緩沖液pH低于3.0時,固定化漆酶活性減少較快,酶的穩定性較差。實施例2的固定化漆酶與此類似。

實施例5固定化漆酶處理氯酚類廢水的效果

將5g實施例1中的固定化漆酶裝入循環固定化酶反應裝置中,在25℃條件下半連續處理酚類污染物,氧化2,6-二氯酚和2,4,6-三氯酚,當反應循環進行1h后,有70%的2,4,6-三氯酚和47·9%的2,6-二氯酚被氧化;2h后,98%的2,4,6-三氯酚和70%的2,6-二氯酚被去除。實施例2的固定化漆酶與此類似。

實施例6固定化漆酶的操作穩定性

將5g實施例1中的固定化漆酶裝入循環固定化酶反應裝置中,在25℃條件下半連續處理酚類污染物,氧化2,6-二氯酚和2,4,6-三氯酚,當反應循環進行12批次后,固定化漆酶酶活仍保持60%以上,結果如圖2所示。實施例2的固定化漆酶與此類似。

以上所述僅是本發明的優選實施方式,應當指出,對于本技術領域的普通技術人員來說,在不脫離本發明技術原理的前提下,還可以做出若干改進和潤飾,這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。

關 鍵 詞:
一種 固定 化漆酶 及其 制備 方法 應用
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