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一種用于檢測CYP2C19基因分型的PCR試劑盒.pdf

摘要
申請專利號:

CN201010591109.9

申請日:

20101216

公開號:

CN101988128A

公開日:

20110323

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:

IPC分類號:

C12Q1/68

主分類號:

C12Q1/68

申請人:

蘇州大學,蘇州曠遠生物分子技術有限公司

發明人:

王進,秦正紅,楊舒婷,何曉輝

地址:

215123 江蘇省蘇州市工業園區仁愛路199號蘇州大學醫學部藥理學系

優先權:

CN201010591109A

專利代理機構:

蘇州創元專利商標事務所有限公司

代理人:

馬明渡;王華

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內容摘要

一種用于CYP2C19基因分型的PCR試劑盒,采用一系列經修飾的檢測引物以及高保真DNA聚合酶介導的聚合酶鏈式反應,檢測基因CYP2C19*1/*2型(即681G/A位點)和/或CYP2C19*1/*3型(即636G/A位點)。本發明的試劑盒,可以實現低成本、高效率、高通量檢測CYP2C19基因中影響其編碼的藥物代謝酶活性的兩個位點的堿基類型。這兩個位點的突變可以解釋中國人群相關藥物的弱代謝者,本發明的試劑盒的檢測結果可以用于指導個體化用藥。

權利要求書

1.一種用于檢測CYP2C19基因分型的PCR試劑盒,其特征在于:所述試劑盒包括檢測基因CYP2C19*1/*2型的兩條正向引物以及一條反向引物,和/或檢測基因CYP2C19*1/*3型的兩條反向引物以及一條正向引物:所述檢測基因CYP2C19*1/*2型的兩條正向引物以及一條反向引物的堿基序列如下所示:正向引物:5’-TCCCACTATCATTGATTATTTCTCG-3’;5’-TCCCACTATCATTGATTATTTCTCA-3’;反向引物:5’–TGAATCACAAATACGCAAGCAGTC-3’;所述檢測基因CYP2C19*1/*3型的兩條反向引物以及一條正向引物的堿基序列如下所示:反向引物:5’-ACTTGGCCTTACCTGGATC-3’;5’-ACTTGGCCTTACCTGGATT-3’;正向引物:5’-TAGCTTCACCCTGTGATCC-3’。2.根據權利要求1所述的用于檢測CYP2C19基因分型的PCR試劑盒,其特征在于:所述正向引物的3’端-1與-2位堿基之間采用耐3’→5’核酸外切酶活性的修飾。3.根據權利要求2所述的用于檢測CYP2C19基因分型的PCR試劑盒,其特征在于:所述耐3’→5’核酸外切酶活性的修飾為硫代磷酸化修飾。4.根據權利要求1所述的用于檢測CYP2C19基因分型的PCR試劑盒,其特征在于:所述反向引物的3’端-1與-2位堿基之間采用耐3’→5’核酸外切酶活性的修飾。5.根據權利要求4所述的用于檢測CYP2C19基因分型的PCR試劑盒,其特征在于:所述耐3’→5’核酸外切酶活性的修飾為硫代磷酸化修飾。

說明書

?

技術領域

本發明涉及一種用于檢測CYP2C19基因分型的PCR試劑盒,特別涉及一種應用聚合酶鏈式反應(PCR)方法檢測影響臨床常用藥物代謝的細胞色素P450酶2C19基因的兩個位點的基因型,即CYP2C19?*1/?*2型(681G/A)與CYP2C19?*1/?*3型(636?G/A)的試劑盒,屬于生物醫學領域中的臨床分子檢測技術。

背景技術

細胞色素P450(CytochromeP450,CYP450)是由一組結構和功能相關的超家族基因(Superfamily?gene)編碼的同工酶,對于人類,其主要存在于肝細胞微粒體中。在CYP450超家族中,CYP2是最大的家族,有15個亞家族(CYP2A到2Q),它們代謝約?20?%目前臨床使用的藥物,其中CYP2A、?CYP2C、CYP2D和CYP2E均具有遺傳多態性和種族差異。人的肝臟中CYP2C約占20%,現已克隆出CYP2C8、2C9/10、2C18和2C19。近年來CYP450的基因型與不同個體的藥物代謝酶活性的相關性的研究有很大進展,通過檢測編碼相關藥物代謝酶的基因型來判斷不同個體對藥物的代謝以及藥效、不良反應情況,從而指導用藥,達到個體化醫療的目的。

CYP2C19(S-美芬妥英羥化酶)是CYP450的主要成分之一,代謝一系列臨床上常用藥物,如美芬妥英、奧美拉唑、普奈洛爾、地西泮、去甲地西泮,舍曲林及氯吡格雷等,其活性存在顯著的個體差異,表現為遺傳多態性,從而表現為血藥濃度的個體差異。中國人常見的兩個CYP2C19等位基因多態性是CYP2C19*2/*2型和CYP2C19*3/*3型,分別為CYP2C19基因的第5?外顯子G681A和第4外顯子G636A的點突變。其中G681A點突變產生了一個異常的拼接位點,使外顯子5’端的前40bp堿基發生缺失,改變了隨后的mRNA的閱讀框,從而使蛋白的合成過早終止,導致合成的酶缺乏血紅素結合位點,使其失去活性。G636A點突變使編碼色氨酸的密碼子突變為終止密碼子,也導致了蛋白合成提前終止,使該蛋白因缺乏血紅素及底物結合區而無活性。這些點突變引起編碼的酶的活性下降,代謝底物的能力減弱,使血藥濃度增高,從而引起與血藥濃度相關的藥物不良反應。

研究表明,CYP2C19對藥物代謝的能力隨著等位基因的不同組合而呈現出一定的規律性,表現為:正?;蚣兒献?gt;?正?;蚺c突變基因雜合子>突變基因純合子或雜合子,即通常所說的基因劑量效應。CYP2C19*1/*1野生純合子代表的是強代謝者(EM,extensive?metabolisers),CYP2C19*2/*2或CYP2C19*3/*3?突變純合子代表的是弱代謝者(PM,poor?metabolisers),CYP2C19*1/*2?或CYP2C19*1/*3?雜合子代表的是中間代謝者(IM),即雜合子強代謝者。CYP2C19*2/*2和CYP2C19*3/*3這兩個點突變可以完全解釋中國人群弱代謝者(PM)。

奧美拉唑是目前應用最為廣泛的質子泵抑制劑(PPI)之一,能抑制胃酸分泌,對H2?受體阻滯劑治療無效的難治性潰瘍也有突出療效,其兩條主要代謝途徑為羥化代謝和S?原子氧化代謝。奧美拉唑羥化代謝受CYP2C19?遺傳基因調控。在CYP2C19?EM人群中,80%都是由CYP2C19代謝,CYP3A介導的S?原子氧化則是CYP2C19?PM人群中的主要代謝途徑。奧美拉唑代謝存在顯著的個體差異,?CYP2C19的PM人群奧美拉唑的血藥濃度高于EM人群的5?倍左右,因而應用等量奧美拉唑的PM者療效顯著優于EM者。然而,值得注意的是,長期大劑量使用PPI?治療會增加髖部骨折的危險,并且劑量越大,骨折危險性越高,這與質子泵抑制劑減少鈣的吸收有關,因此根據CYP2C19基因型的多態性來選擇最小有效劑量治療有適應證的患者有重要的臨床意義。?

目前用于檢測CYP2C19基因型的方法有很多種,常規是首先抽取人外周靜脈血,提取基因組DNA,擴增CYP2C19突變所在區域序列,然后進行DNA直接測序,從測序結果判斷相應位點的基因型,這種常規基因檢測方法雖然可以達到檢測的目的,但是直接測序的檢測周期長、操作步驟過于繁瑣、不能及時得到結果報告;直接測序的成本較高,這給患者以及醫療單位帶來較大經濟支出;另一種較為常見的檢測方法為RFLP(限制性內切酶酶解片段長度多態性),這一方法具有簡便、經濟和可靠的特點,但其具有酶切位點局限性,并且難以進行高通量平行分析;還有一種普通PCR技術,其采用一對普通引物和低保真聚合酶Taq進行PCR擴增,得到的結果特異性不高,常常造成假陽性。上述三種方法都不能滿足臨床檢驗科室進行CYP2C19基因型檢測的要求。

發明內容

本發明提供一種應用高保真DNA聚合酶介導的聚合酶鏈式反應(PCR)CYP2C19基因分型的PCR試劑盒,包含檢測CYP2C19*1/*2型和CYP2C19*1/*3型,分別為CYP2C19基因的第5外顯子G681A和第4外顯子G636A的點突變。目的是解決現有用PCR擴增方法檢測CYP2C19的基因型時價格昂貴、低效率、低通量以及假陽性高的問題。

為達到上述目的,本發明采用的技術方案是:一種用于檢測CYP2C19基因分型的PCR試劑盒,其特征在于:所述試劑盒包括檢測基因CYP2C19*1/*2型(即681?G/A位點)的兩條正向引物以及一條反向引物,和/或檢測基因CYP2C19*1/*3型(即636?G/A位點)的兩條反向引物以及一條正向引物:

所述檢測基因CYP2C19*1/*2型(即681?G/A位點)的兩條正向引物以及一條反向引物的堿基序列如下所示:

正向引物:

CYP2C19?681G:5’-TCCCACTATCATTGATTATTTCTCG-3’;

CYP2C19?681A:5’-TCCCACTATCATTGATTATTTCTCA-3’;

反向引物:

CYP2C19?681R:5’?–TGAATCACAAATACGCAAGCAGTC-3’;

所述檢測基因CYP2C19*1/*3型(即636?G/A位點)的兩條反向引物以及一條正向引物的堿基序列如下所示:

反向引物:

CYP2C19?636G:5’-ACTTGGCCTTACCTGGATC-3’;

CYP2C19?636A:5’-ACTTGGCCTTACCTGGATT-3’;

正向引物:

CYP2C19?636F:5’-TAGCTTCACCCTGTGATCC-3’。

上述技術方案中的有關內容解釋如下:

1、上述方案中,所述正向引物的3’端-1與-2位堿基之間采用耐3’→5’核酸外切酶活性的修飾。

2、上述方案中,所述耐3’→5’核酸外切酶活性的修飾為硫代磷酸化修飾。

3、上述方案中,所述反向引物的3’端-1與-2位堿基之間采用耐3’→5’核酸外切酶活性的修飾。

4、上述方案中,所述耐3’→5’核酸外切酶活性的修飾為硫代磷酸化修飾。

5、上述方案中:所述引物(primer)是PCR(聚合酶鏈式反應)技術中重要的組成部分,它是一小段單鏈DNA,作為DNA復制的起始點,在核酸合成反應時,作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發點而起作用的多核苷酸鏈,在引物的3′-OH上,核苷酸以二酯鍵形式進行合成,因此引物的3′-OH必須是游離的。

6、上述方案中,所述硫代磷酸化修飾是指在普通引物合成的基礎上,3′端兩個單核苷酸之間磷酸二酯鍵上的-OH被-SH所取代,從而達到耐核酸外切酶消化的效果。

7、本發明工作原理是:PCR(polymerase?chain?reaction)擴增是一種體外擴增DNA片段的方法,即聚合酶鏈式反應方法。采用這種方法,在反應系統中只要有一個拷貝的待擴增DNA片段,在短時間內就能擴增出大量拷貝數的特異性DNA片段。該方法廣泛應用于基因檢測。PCR擴增的基本原理是:模仿細胞內發生的DNA復制過程,以DNA互補鏈聚合反應為基礎,通過靶DNA變性、引物與模板DNA(待擴增DNA)一側的互補序列退火復性、耐熱性DNA聚合酶催化引物延伸等過程的多次循環,產生待擴增的特異性DNA片段。由于上一次循環合成的兩條互補鏈均可作為下一次循環的模板DNA鏈,所以每循環一次,底物DNA的拷貝數增加一倍,因此PCR經過n次循環后,理論上,待擴增的特異性DNA片段可達到2n個拷貝數。Touchdown?PCR,即降落PCR。是優化和改良后的一種PCR方法,指每一個(或n個)循環降低1℃(或n℃)退火溫度,直至達到一個較低的退火溫度(touchdown退火溫度)。然后以此溫度進行多個循環。正確和非正確退火溫度1℃差異將造成PCR產物量4倍的差異,如果相差n℃,就會產生4的n次方倍的優勢,因此,相對于非正確產物,正確產物可以得到大量的富集。退火溫度起始在高于計算的Tm值15℃左右,再接下來的循環中,退火溫度以每次1-2℃逐漸降低,直到Tm值以下5℃,當達到特異的引物-模板結合的Tm值時,擴增就會開始。當退火溫度降到非特異擴增發生的水平時,特異產物會在與非特異擴增的競爭中勝出,成為主導的擴增產物避免非特異擴增產物的出現。此擴增方法有利于PCR產物的純化和假陽性的降低。

由于上述技術方案運用,本發明與現有技術相比具有下列優點和效果:

1、本發明的試劑盒采用特殊設計的引物,并且在其引物的3′端采用硫代磷酸化修飾,其PCR產物特異性非常高。利用本發明的系列檢測引物,在PCR結束并進行凝膠電泳后,可通過直接觀察產物的有無來快速判斷CYP2C19的基因型,包含CYP2C19基因的第5?外顯子G681A?和第4?外顯子G636A?的點突變的堿基類型。

2、本發明的試劑盒采用特殊的“降落PCR”程序,大大減少了由于Tm值太低而導致的引物與模板在錯誤位點的結合,從而提高了PCR效率和靈敏度,為準確檢測CYP2C19的基因型提供了技術支持。

3、本發明的試劑盒的核心成分(檢測引物)價格低廉,而且在實驗過程中不需測序,在節省了檢測成本的同時,大大縮短了檢測周期,提高了檢測的效率。

4、本發明的試劑盒和實時熒光定量PCR結合,可以實現高通量檢測CYP2C19的基因型。

附圖說明

附圖1為采用試劑盒中的檢測基因CYP2C19?*1/*2型(即681?G/A位點)的兩條正向引物以及一條反向引物檢測三個人類基因組DNA樣品得到的瓊脂糖凝膠電泳圖。

附圖2為附圖1中所示的樣品1(左側)的DNA測序圖。

附圖3為附圖1中所示的樣品2(中間)的DNA測序圖。

附圖4為附圖1中所示的樣品3(右側)的DNA測序圖。

附圖5為采用試劑盒中的檢測基因CYP2C19?*1/*3型(即636?G/A位點)的兩條反向引物以及一條正向引物檢測兩個人類基因組DNA樣品得到的瓊脂糖凝膠電泳圖。

附圖6為附圖5中所示的樣品4(左側)的DNA測序圖。

附圖7為附圖5中所示的樣品5(右側)的DNA測序圖。

附圖8為PCR溫度循環條件。

具體實施方式

下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述:

實施例一:一種用于檢測CYP2C19基因分型的PCR試劑盒

一種用于檢測CYP2C19基因分型的PCR試劑盒包含:

10×PCR?Buffer;

dNTP?(2.5mM);

Pfu?DNA聚合酶(2.5U/μl);

引物(各10mM);

檢測基因CYP2C19?*1/*2型(即681?G/A位點)的兩條正向引物以及一條反向引物的堿基序列如下所示:

正向引物:

CYP2C19?681G:?5’-TCCCACTATCATTGATTATTTCTCG-3’;

CYP2C19?681A:?5’-TCCCACTATCATTGATTATTTCTCA-3’;

反向引物:

CYP2C19?681R:??5’?-TGAATCACAAATACGCAAGCAGTC-3’;

上述正向引物的3’端-1,-2位堿基之間硫代磷酸化修飾。

檢測基因CYP2C19?*1/*3型(即636?G/A位點)的兩條反向引物以及一條正向引物如下所示:

反向引物:

CYP2C19?636G:?5’-ACTTGGCCTTACCTGGATC-3’;

CYP2C19?636A:?5’-ACTTGGCCTTACCTGGATT-3’;

正向引物:

CYP2C19?636F:?5’-TAGCTTCACCCTGTGATCC-3’;

上述反向引物的3’端-1,-2位堿基之間硫代磷酸化修飾。

采用該試劑盒進行實驗包括下列步驟:

第一步:準備DNA

(1)、從待檢測者抽取血液樣本,得到樣品1~5。

(2)、從血液樣本中獲取DNA,我們采用上海生工生產的UNIQ-10試劑盒進行提取。

從待檢測者的血樣中獲取DNA過程:

a.取500ul已加入ACD(0.48%Citric?Acid(檸檬酸);1.32%SodiumCitrate(檸檬酸鈉);1.47%Glucose(葡萄糖))抗凝劑的血樣。

b.?500ul血樣中加入1ml無菌水,5000轉/分,離心兩分鐘去上清,用200ul?TE將白細胞懸浮起來。

c.?在b步驟制備的200ul樣品中,加入200ul?Digestion?Buffer混勻,再加入20ul的Proteinase?K(蛋白酶K)(10mg/ml),混勻,55℃保存30分鐘。

d.?加入200ul?BD?Buffer,70℃孵育10分鐘。

e.?加入200ul無水乙醇,混勻,然后用1-ml?Tip頭將樣品全部轉移到UNIQ-10柱,柱子放入2.0-ml?Collection?Tube。

f.?用臺式離心機,10000轉/分,室溫離心1分鐘。

g.?取下UNIQ-10柱,棄去Collection?Tube中的廢液。將柱子放回同一根Collection?Tube中,加入500ul?PW?Solution,10000轉/分,室溫離心1分鐘。

h.?取下UNIQ-10柱,棄去Collection?Tube中的廢液。將柱子放回同一根Collection?Tube中,加入500ul?Wash?Solution,10000轉/分,室溫離心1分鐘。

i.?取下UNIQ-10柱,棄去Collection?Tube中的全部廢液。將柱子放回同一根Collection?Tube中,10000轉/分,室溫離心1分鐘以除去殘留的Wash?Solution。

j.?將柱子放入新的無菌的1.5ml離心管中,在柱子中央加入50ul?60度預熱的Elution?Buffer,室溫放置5分鐘。

k.?10000轉/分,室溫離心1分鐘,離心管中的液體即為血液中基因組DNA。

第二步:對DNA進行擴增

PCR擴增進行兩次,分別采用檢測基因CYP2C19?*1/*2型(即681?G/A位點)和/或CYP2C19?*1/*3型(即636?G/A位點)的引物,PCR擴增的程序相同:

采用40ng/50ul的反應體系,具體操作為:

1、將上述一系列檢測引物分別與獲取的六個樣品的基因組DNA、4種脫氧核糖核苷酸、PCR反應緩沖液、高保真Pfu?DNA聚合酶、去離子水按一定比例混合構成單獨的反應體系,具體見下表:

ddH2OTo?50μl10×PCR???Buffer5μldNTP?(2.5mM)4.0μl引物(各10mM)各1μlPfu?DNA聚合酶(2.5U/μl)0.2μl7個樣品的基因組DNA(約80ng/μl)0.5μl

2、對上述反應體系進行PCR溫度循環,?PCR溫度循環條件見附圖8:

第三步:凝膠電泳

采用凝膠電泳系統對上述DNA擴增后的體系做凝膠電泳,得到的凝膠電泳圖如附圖1、附圖5、附圖8所示。

第四步:觀測結果

(1)采用檢測基因CYP2C19?*1/*2型(即681?G/A位點)的引物檢測樣品1~3的基因組DNA得到的凝膠電泳如附圖1所示。

附圖1中第1泳道有產物,而第2泳道無產物,顯示該樣本的CYP2C19基因的681位點是AA突變純合子,該結果與該樣本直接DNA測序結果(附圖2)相一致。

附圖1中第3泳道、第4泳道均有產物,顯示該樣本的CYP2C19基因的681位點是AG突變雜合子,該結果與該樣本直接DNA測序結果(附圖3)相一致。

附圖1中第5泳道無產物,而第6泳道有產物,顯示該樣本的CYP2C19基因的681位點是GG正常純合子,該結果與該樣本直接DNA測序結果(附圖4)相一致。

(2)采用檢測基因CYP2C19?*1/*3型(即636?G/A位點)的引物檢測樣品4~5基因組DNA得到的凝膠電泳如附圖5所示。

附圖5中第1泳道無產物,而第2泳道有產物,顯示該樣本的CYP2C19基因的636位點是GG正常純合子,該結果與該樣本直接DNA測序結果(附圖6)相一致。

附圖5中第3泳道有產物,而第4泳道有產物,顯示該樣本的CYP2C19基因的636位點是AG突變雜合子,該結果與該樣本直接DNA測序結果(附圖7)相一致。

(3)采用檢測基因CYP2C19?*1/*3型(即636?G/A位點)的引物檢測人工突變質粒樣本得到的凝膠電泳如附圖8所示。

附圖8中第1泳道無產物,而第2泳道有產物,顯示該樣本的CYP2C19基因的636位點是GG正常純合子,該結果與該樣本直接DNA測序結果(附圖9)相一致。

附圖8中第3泳道有產物,而第4泳道無產物,顯示該樣本的CYP2C19基因的636位點是AA突變純合子,該結果與該樣本直接DNA測序結果(附圖10)相一致。

上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點,其目的在于讓熟悉此項技術的人士能夠了解本發明的內容并據以實施,并不能以此限制本發明的保護范圍。凡根據本發明精神實質所作的等效變化或修飾,都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。

序列表

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關 鍵 詞:
一種 用于 檢測 CYP2C19 基因 PCR 試劑盒
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