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一種TNFa基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN200910056089.2

申請日:

20090807

公開號:

CN101988103A

公開日:

20110323

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:

IPC分類號:

C12Q1/68

主分類號:

C12Q1/68

申請人:

芮屈生物技術(上海)有限公司

發明人:

裘建英,張云福

地址:

201108 上海市閔行區光華路728號4幢426室

優先權:

CN200910056089A

專利代理機構:

上海翼勝專利商標事務所(普通合伙)

代理人:

翟羽

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內容摘要

本發明涉及一種TNFa基因的原位雜交檢測試劑盒,包括雜交探針、標記物,所述的雜交探針序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發明還提供了一種TNFa基因原位雜交檢測方法。另外,本發明還提供了試劑盒在制備檢測胃癌疾病藥物中的應用。本發明優點在于:本發明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。本發明的檢測方法操作方便、簡單,能在區級以上醫院普遍使用和推廣。

權利要求書

1.一種TNFa基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測胃癌疾病藥物中的應用,所述的試劑盒包括雜交探針、標記物,所述的雜交探針序列如SEQ?ID?NO.1所示。2.根據權利要求1所述的應用,其特征在于:所述的雜交探針序列如SEQ?ID?NO.1所示的RNA序列。3.根據權利要求1或2所述的應用,其特征在于:所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。4.根據權利要求3所述的應用,其特征在于:所述的放射性核素選自H、S、I或P中的一種。5.根據權利要求3所述的應用,其特征在于:所述的非放射性標記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的一種。6.根據權利要求5所述的應用,其特征在于:所述的非放射性標記物優選自地高辛。7.根據權利要求1或2所述的應用,其特征在于:所述的試劑盒還包括增效劑,所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。8.一種TNFa基因的原位雜交檢測試劑盒,包括雜交探針、標記物,其特征在于,所述的雜交探針序列如SEQ?ID?NO.1所示,所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。9.一種TNFa基因的原位雜交檢測方法,其特征在于,該方法包括以下步驟:a、將權利要求8所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸,形成雜交復合體;b、檢測a步驟得到的雜交復合體。10.根據權利要求9所述的檢測方法,其特征在于:a步驟中形成雜交復合體的條件為:核酸雜交的溫度為42℃;核酸雜交的時間為16-24小時,所述的底物選用血液細胞標本或組織細胞標本。

說明書

?

【技術領域】

本發明涉及一種試劑盒,具體地說關于一種TNFa基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用

【背景技術】

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一,在我國其發病率居各類腫瘤的首位。中國的胃癌發病率以西北最高東北及內蒙古次之華東及沿海又次之中南及西南最低每年約有17萬人死于胃癌,幾乎接近全部惡性腫瘤死亡人數的1/4,且每年還有2萬以上新的胃癌病人產生出來,胃癌確實是一種嚴重威脅人民身體健康的疾病。胃癌可發生于任何年齡,但以40~60歲多見,男多于女約為2∶1。其發病原因不明,可能與多種因素,如生活習慣、飲食種類、環境因素、遺傳素質、精神因素等有關,也與慢性胃炎、胃息肉、胃黏膜異形增生和腸上皮化生、手術后殘胃,以及長期幽門螺桿菌(HP)感染等有一定的關系。

研究發現TNFa與過渡期胃癌有關,TNFa細胞因子對胃癌來說是一組有用的預后不良有關的腫瘤標志物。TNFa的基因序列號:AF043342,486bp,mRNA,cds:1…474bp。

隨著分子生物技術日益完善,功能基因組學,癌癥基因組學等研究的深入展開,至今,我們已有可能在基因水平上做更精確的早期診斷,在癌變前期或癌細胞形成(單克隆時)就能做到基因水平的早期預測診斷。

原位雜交技術(in?situ?hybridization)是將分子生物學與細胞化學技術結合起來,以標記的核酸分子為探針,在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術。其原理是使含有特異序列、經過標記的核酸單鏈(即探針),在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發生雜交,再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測,從而在細胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。

【發明內容】

本發明的目的是針對現有技術中的不足,提供一種TNFa基因的原位雜交檢測試劑盒的用途。

本發明的再一的目的是,提供一種TNFa基因的原位雜交檢測試劑盒。

本發明的另一的目的是,提供一種TNFa基因的原位雜交檢測方法。

為實現上述目的,本發明采取的技術方案是:

一種TNFa基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測胃癌疾病藥物中的應用,所述的試劑盒包括雜交探針、標記物,所述的雜交探針序列如SEQ?ID?NO.1所示。

所述的雜交探針序列如SEQ?ID?NO.1所示的RNA序列。

所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。

所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P中的一種。

所述的非放射性標記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的一種。

所述的非放射性標記物優選自地高辛。

所述的試劑盒還包括增效劑,所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。

為實現上述第二個目的,本發明采取的技術方案是:

一種TNFa基因的原位雜交檢測試劑盒,包括雜交探針、標記物,其中所述的雜交探針序列如SEQ?ID?NO.1所示,所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。

為實現上述第三個目的,本發明采取的技術方案是:

一種TNFa基因的原位雜交檢測方法,該方法包括以下步驟:

a、將試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸,形成雜交復合體;

b、檢測a步驟得到的雜交復合體。

所述的a步驟中形成雜交復合體的條件為:核酸雜交的溫度為42℃;核酸雜交的時間為16-24小時,所述的底物選用血液細胞標本或組織細胞標本。

本發明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針,雜交液,顯色劑,增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業內人士均熟知,具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結果報告,其中雜交的具體步驟包括:

儀器操作:

1).將待測標本放入反應槽中;

2).儀器自動棄去液體,自動加消化液;

3).儀器自動棄去液體,自動后固定;

4).儀器自動棄去液體,自動預雜交(42℃);

5).儀器自動棄去液體,自動清洗;

6).儀器自動棄去液體,自動雜交(42℃);

7).儀器自動棄去液體,自動清洗;

8).儀器自動棄去液體,自動與DIG抗體培養(室溫);

9).儀器自動棄去液體,自動清洗,顯色;

10).取出封片鏡檢。

本發明優點在于:

1、本發明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。

2、本發明的檢測方法操作方便、簡單,能在區級以上醫院普遍使用和推廣。

3、本發明的臨床意義是更早期跟蹤檢測胃癌發生動態過程,以及用于胃癌預防醫學的檢測和篩選工具。本發明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測癌胚蛋白標志物,以及影像醫學檢查有顯著不同。本發明可以在基因水平上檢測TNFa異常表達,在影像醫學檢查及其它檢查未發現占位性胃癌病灶之前,癌癥生化指標未產生異常之前,亦未形成腫塊之前,能及早做到以上基因表達異常的信息采集,給臨床胃癌病患一個真正的預后早期診斷。這樣才有可能實施胃癌的早期診斷、早期預防、早期治療,有可能從源頭上徹底根治胃癌惡疾。

【附圖說明】

圖1是本發明實施例中胃癌病人TNFa基因表達圖片。

圖2是本發明實施例中正常人TNFa基因表達圖片。

【具體實施方式】

下面結合附圖對本發明具體實施方式作詳細說明。

實施例1

一種TNFa基因的原位雜交檢測試劑盒,包括雜交探針、標記物、增效劑,其中,所述的雜交探針序列如SEQ?ID?NO.1所示。雜交探針用地高辛標記。試劑盒中的其它液體和標本組成如下:

消化液??????100μl/管????1管/盒????無色透明液體

保護液??????100μl/管????1管/盒????無色透明液體

預雜交液????1300μl/管???2管/盒????無色透明液體

正義雜交液????????10μl/管????1管/盒????無色透明液體

反義雜交液????????10μl/管????1管/盒????無色透明液體

封閉液????????????1000μl/管??1管/盒????無色透明液體

堿性磷酸酶抗體????1μl/管?????1管/盒????無色透明液體

顯色劑A???????????175μl/管???1管/盒????黃色液體

顯色劑B???????????320μl/管???1管/盒????無色透明液體

緩沖液I?10x???????90ml/瓶?????1瓶/盒????淺黃色或無色透明液體

緩沖液II?10x??????80ml/瓶?????1瓶/盒????淺黃色或無色透明液體

緩沖液III?10x?????20m/瓶??????3瓶/盒????淺黃色或無色透明液體

緩沖液IV?10x??????90ml/瓶?????1瓶/盒????淺黃色或無色透明液體

固定液????????????90ml/瓶?????1瓶/盒????無色透明液體

陽性對照標本??????6片/盒

上述試劑成分說明:(所有試劑購自SIGMA)

1、消化液:20mg/ml蛋白酶K,100mg蛋白酶K,加DEPC-H2O?5ml;

2、保護液:0.2g的glycine加入1ml的1×緩沖液I;

3、預雜交液:1×緩沖液II?7.5ml

50×D?3ml

10mg/ml?yest?t-RNA?750ul

11mg/ml?SALMON?TESTES?DNA??682ul

0.04M?EDTA?3ml

50%formamide?15ml

4、封閉液:0.03g的bloking(購買自羅氏公司)加入1ml?1×緩沖液III;

5、10x緩沖液I:(PH7.1-7.4)

NaCl?80g

Na2HPO4.12H2O??360g

KCl??2g

KH2PO42g

加三蒸水至1l,并高壓滅菌;

6、10x緩沖液II:(PH7.0)

NaCl??175.3g

檸檬酸鈉88.2g

HCl幾滴

加三蒸水至1l,并高壓滅菌;

7、緩沖液III:(PH7.9)

Tris??121.1g

NaCl??87.66g

HCl??60ml左右

加三蒸水至1l,并高壓滅菌;

8、緩沖液IV:

1M?Tris-HCl(PH9.5):Tirs?121.1g加HCl?3ml左右,加水900ml,調PH至9.5,加水至1l,并高壓滅菌;

1M?NaCl:NaCl?58.44加水至1l,并高壓滅菌;

0.5M?MgCl2:101.65g?MgCl2.6H2O加水至1l,并高壓滅菌;

9、固定液:多聚甲醛40g加1×緩沖液I至1l,稍加熱(約50-60度)攪拌至溶解;

10、顯色劑A:NBT?1g加70%DMF11.44ml;

11、顯色劑B:BCIP?1g加100%DMF30ml。

本發明的試劑盒可以多人份使用或一人份使用。

實施例2

一種TNFa基因原位雜交檢測方法及其試劑盒應用

一、標本處理

1、用10ml的離心管,裝4.5ml淋巴細胞分離液,再將3ml抗凝血緩慢加入含有淋巴細胞分離液(血∶淋巴細胞分離液=1∶1.5)的離心管中,2000r/min離心10min;

2、吸取中間層白細胞至另一離心管中,再在此管中加入約兩倍的1×緩沖液I,混勻,1500g/min離心10min;

3、棄上清.沉淀加入約兩倍的1×緩沖液I,混勻,1500g/min離心10min;

4、棄上清,并把試管口多余的液體用擦手紙吸去。再將沉淀制成懸液,滴在玻片上推片,自然干燥。(有條件的醫院可以用制片機制片。)3ml血,可以做4張片子;

5、用40ml?4%固定液,在玻璃缸中,固定30min,再用1×緩沖液I洗5min。每缸可以放16片;

6、標本可保存在-20℃,或繼續做實驗。

二、將試劑盒中試劑配制成使用濃度

1、將10×緩沖液I用三蒸水按1∶10稀釋成1×緩沖液I;

2、將20×緩沖液II用三蒸水按1∶10稀釋成2×緩沖液II;

按1∶100稀釋成0.2×緩沖液II;按1∶200稀釋成0.1×緩沖液II;

3、將10×緩沖液III用三蒸水按1∶10稀釋成1×緩沖液III;

4、10×緩沖液IV用三蒸水按1∶10稀釋成×緩沖液IV(取1#,2#,3#各10ml,加水至100ml既可)。

三、實驗步驟:

1、取每位待檢者標本兩張,(另外兩張留作復查用)及陽性對照標本兩張(每次實驗做一對陽性對照);

2、在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1×緩沖液199.9ml,即為使用濃度)20ml。37℃水浴預熱10分鐘。放進16張玻片,37℃處理12min,再用1×緩沖液I洗5min;

3、用0.2%的保護液(保護液1ml加1×緩沖液I99ml即為使用濃度)洗10min,三蒸水洗5min,以上過程都在玻璃缸進行。玻片自然干燥;

4、將玻片放入保濕盒內,加預雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片,蓋緊保濕盒,放在42℃恒溫水浴箱中3h以上;

5、取出玻片,棄去蓋玻片,將玻片放入玻璃缸內,用70%,90%,95%的乙醇各洗2min,自然干燥;

6、將玻片放入保濕盒內,每位病人標本兩張,一張加正義雜交液20ul/片,另一張加反義雜交液20ul/片,蓋上蓋玻片,蓋緊保濕盒,放在42℃恒溫水浴箱中16-24h;

7、取出玻片,棄去蓋玻片,將玻片放入玻璃缸內

在42℃恒溫水浴箱中用2×緩沖液II洗兩次,每次15min

在42℃恒溫水浴箱中用0.2×緩沖液II洗一次,每次15min

在42℃恒溫水浴箱中用0.1×緩沖液II洗兩次,每次15min;

8、用1×緩沖液III洗30s,取出玻片,自然干燥;

9、將玻片放入保濕盒內,加0.5%l封閉液(1ml封閉液加5ml?1×緩沖液III)100ul/片,蓋緊保濕盒,在室溫下作用30min;

10、取出玻片,用1×緩沖液III洗30s,自然干燥;

11、將玻片放入保濕盒內,加堿性磷酸酶抗體(加入1.8ml?1×緩沖液III)100ul/片,蓋緊保濕盒在室溫下作用30min;

12、取出玻片,用1×緩沖液III洗3次,每次15min;

13、1×緩沖液IV洗2min,加顯色劑(顯色劑A73.3ul,顯色劑B157.5ul加到30ml?1×緩沖液IV中,混勻),室溫避光12h以上;

14、用三蒸水洗5min,自然干燥,(用甘油加10%的1×緩沖液I混勻)封片鏡檢。

四、結果判斷

在光鏡下計數100-300個細胞,計算染上紫色細胞的百分比。

陽性對照標本加反義雜交液的應該80%以上染上紫色。

所有加正義雜交液的陰性內對照應無色。

地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針,不但探針的具有生物素標記優點,還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內源性生物素干憂等缺點),將該雜交探針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交,再用免疫組化的方法顯色,在光鏡下觀察mRNA的存在和定位,根據染色的細胞數,判斷目的基因的表達量。

本發明方法是目前常用的核酸原位雜交技術,該方法通過檢測底物細胞中的TNFa基因表達量,用來確定胃癌是否發生。臨床研究表明,TNFa基因是胃癌的特異基因,因為TNFa基因在正常人中不表達,唯獨在癌表達,說明胃癌已經發生,用來確定胃癌是否發生,或是正常。從而獲得胃癌的診斷信息。具體結果請見圖1和圖2。

實施例3

用TNFa基因試劑盒檢測胃癌疾病與用VEGF基因試劑盒檢測胃癌疾病之間平行實驗。

為了科學評價上述基因各自在胃癌疾病的特異性、敏感性、準確性。我們用平行試驗的方法,同時檢測上述基因的mRNA,檢測技術采用核酸原位雜交技術,用同一例胃癌疾病患者的外周血,同時檢測TNFa基因和VEGF(VEGF基因序列號NM-001025366,6p12”3665bp?cds:492。。。。1730bp)基因的mRNA(進行核酸原位雜交、免疫組化染色、鏡下記數、結果報告等均采用實施例1和實施例2的原位雜交技術的相同方法和步驟及試劑)。發現TNFa基因在胃癌疾病病人中表達量比VEGF基因在同一疾病病人的表達量要高。結果表明,TNFa基因對胃癌疾病診斷的特異性、敏感性、準確性比VEGF基因更好,原位雜交基因表達圖顯示,TNFa基因的表達量是70%,VEGF基因的表達量是50%。本發明的試劑盒作于胃癌疾病診斷的指標有非常重要的臨床意義。

以上所述僅是本發明的優選實施方式,應當指出,對于本技術領域的普通技術人員,在不脫離本發明方法的前提下,還可以做出若干改進和補充,這些改進和補充也應視為本發明的保護范圍。

SEQUENCE?LISTING

<110>芮屈生物技術(上海)有限公司

<120>一種TNFa基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用

<130>/

<160>1

<170>PatentIn?version?3.3

<210>1

<211>486

<212>DNA

<213>智人(Homo?sapiens)

<400>1

gtcagatcat?cttctcgcac?cccgagtgac?aagcctgtag?cccatgttgt?agcaaaccct???60

caagctgagg?ggcagctcca?gtggctgaac?cgccgggcca?atgccctcct?ggccaatggc??120

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caggtcctct?tcaagggcca?aggctgcccc?tccacccatg?tactcctcac?ccacaccatc??240

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