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用于連續快速熱循環系統的方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN200780045281.0

申請日:

20071004

公開號:

CN101589157B

公開日:

20140402

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:

IPC分類號:

C12Q1/68,C12P19/34

主分類號:

C12Q1/68,C12P19/34

申請人:

萬達利亞研究公司

發明人:

威廉·伊恩·托爾樂,邁克爾·路易斯·諾頓,伊麗莎白·默里,德里克·艾倫·格雷戈,賈斯廷·托馬斯·斯維克

地址:

美國西弗吉尼亞州

優先權:

60/850,103

專利代理機構:

北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司

代理人:

王達佐;洪欣

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內容摘要

用于高分子量有機物質諸如DNA的有效、高速、大規模合成法,所述方法需要多個溫度環境。在聚合酶鏈式反應操作中,在存在足量表面吸附聚合物的條件下,將基本上均質的反應物液體通過管道輸送通過最少兩個溫度帶,所述足量表面吸附聚合物條件化管道并保護催化酶以提高產量和效率,并將進一步使用所需再生系統的間歇期降到最低。特別地,使用氧化乙烯和環氧丙烷的嵌段共聚物。

權利要求書

1.進行聚合酶鏈式反應的方法,包括將液體連續地運輸通過聚合管道,所述聚合管道被設置為通過第一反應循環區域和至少第二反應循環區域,所述區域中的每個均包含至少第一溫度帶和第二溫度帶,所述至少第二反應循環區域中每個帶的溫度與所述第一反應循環區域中相應的第一溫度帶和第二溫度帶的溫度基本相同,其中所述液體是均質水溶液,其含有溶解于所述均質水溶液中的聚合酶鏈式反應(PCR)的反應物和氧化乙烯和環氧丙烷的嵌段共聚物。2.如權利要求1所述的方法,其中所述方法包括輸送所述液體通過約10到40個反應循環區域,所述反應循環區域中的每個均包含至少第一溫度帶和第二溫度帶,所述反應循環區域中每個帶的溫度與所述第一反應循環區域中對應帶的溫度基本相同。3.如權利要求1所述的方法,其中所述聚合管道是柔性聚四氟乙烯管道。4.如權利要求1所述的方法,其中輸送所述液體進入、通過并流出所述聚合管道,所述聚合管道中沒有物理屏障。5.如權利要求1所述的方法,其中所述反應循環區域中的每個均包含第一溫度帶、第二溫度帶和第三溫度帶。6.如權利要求5所述的方法,其中所述第一溫度帶的溫度為約94-96℃,所述第二溫度帶的溫度為約55-60℃,和所述第三溫度帶的溫度為約70-73℃。7.進行聚合酶鏈式反應的方法,其包括以下步驟:a)將含有氧化乙烯和環氧丙烷的嵌段共聚物的水溶液輸送通過聚合管道,繼之以;b)在足以引起所述聚合酶鏈式反應的溫度下,將含有PCR反應物的第二水溶液連續地運輸通過所述管道。

說明書

本申請要求享有2006年10月6日提交的、標題為“Use?of?PluronicF-127?block?copolymer?surfactant,Pluronic?F-68,and?Pluronic?F-108NF?in?anon-static?DNA?amplification?solution(普朗尼克F-127嵌段聚合物表面活性劑、普朗尼克F-68和普朗尼克F-108NF在非靜態DNA擴增溶液中的用途)”的美國臨時專利申請號60/850,103的優先權。

簡介

聚合酶鏈式反應(PCR)是一種三步方法,通常被設計用于診斷、鑒定或法醫目的。第一步,DNA或類似分子在約94-96攝氏度(C)的溫度下被變性,也被稱為裂解、分離或解開。第二步,第一步中產生的鏈在約55-60℃的溫度下與聚合酶起始子即引物反應物退火,也被稱為引發或雜交。第三步,在大約70-73℃下,隨著單個核苷酸堿基的添加,使上述引發的單鏈DNA通過引物延伸來合成復制本DNA。更新的PCR方法也可以使用兩個溫度帶的操作。

PCR裝置通常通過批量方法工作,其中將含有單獨等分量的反應物的多孔板從一個溫度環境物理轉移到另一個溫度環境以完成循環??蛇x擇地,一組盒、微瓶、管或其他容器通過固定的一系列恒溫箱??蛇x擇地,將管置于一個模塊中,該模塊可以被加熱和冷卻以改變所述模塊內的盒、微瓶、管或其他容器包含的液體反應物的溫度。

更詳細地來說,在世界范圍內專業研究人員廣泛使用PCR作為擴增小鏈DNA的手段,所擴增的量足以用于檢測和鑒定。通常,PCR是利用自動熱循環儀實施的,所述自動熱循環儀交替加熱和冷卻眾多包含PCR反應混合物的小管。這類過程利用具有不連續的受限空間的靜態反應器,在該空間中當按照重復順序暴露于不同的溫度時,反應發生。所述過程是時間密集型、勞動密集型和低效的,因為必須分別給管子填裝反應物,密閉,通過自動循環儀處理,打開,并最終倒出含有所需擴增DNA的反應產物。

因此,開發出連續的熱循環儀,通過利用動態反應器以避免需要利用許多小管通過PCR擴增DNA。連續的熱循環儀不是利用小管,而是利用恒量或連續流的流體,所述液體重復通過不同的溫度帶以擴增DNA。連續熱循環儀的一個實例公開于1993年12月14日授權的Corbett等的美國專利號5,270,183。Corbett等人公開了用于DNA擴增的裝置和方法,其中將PCR反應混合物注入載液(PCR反應混合物與其不混溶),然后載液穿過多個溫度帶以促進PCR反應混合物內的DNA擴增。因此,各個反應混合物被大量載液分離。該裝置的功能是加速處理不連續的槽或塞中含有的多種不同DNA鏈,因此需要與PCR反應混合物不混溶的載液,其可以用作分離不同的DNA鏈。該裝置未被設計用于產生大量DNA。

此外,Corbett等的裝置未被設計成容易和快速地適應不同的PCR反應要求。例如,載液穿過溫度帶的優選布置是將傳輸載液的管道纏繞在單獨的圓柱(維持在不同溫度)周圍。因此,將該裝置改造用于不同的反應條件需要將管道圍繞一個或多個圓柱不同的次數,解開圍繞一個或多個圓柱的管道,從而用不同的圓柱替換一個或多個圓柱,按照不同的順序重新設置圍繞圓柱的管道的路徑,或另一種這樣的勞動密集型過程。此外,當反應混合物槽從一個圓柱穿到下一個圓柱時效率和精細的溫度控制被減弱,并且在這類“缺口”中熱能被無意丟失或獲得。

連續熱循環儀的另一個實例公開于Curico,M.和Roeraade,J.(2003,于2002年網絡公開)Continuous?Segmented?Flow?Polymerase?ChainReaction?for?High-Throughput?Miniaturized?DNA?Amplification(用于高通量小型化DNA擴增的連續分段流動聚合酶鏈式反應),Anal.Chem.75,1-7。該裝置類似地被設計用于多種被不混溶流體分離的小樣品混合物。但是,該裝置使用分離的熱控水浴作為溫度帶;而不是如Corbett等的裝置利用分離的圓柱作為不同的溫度帶。該裝置未被設計成容易改造用于提供大量不同的反應條件,因為對于這種改造必須準備和添加額外的水浴。該裝置的使用還需要周期性的為水浴添水、檢查和排水,以及清理水浴容器。

Hansen的于1996年4月16日出版的美國專利5,508,197教導了一種PCR裝置,其具有96、192和384孔形式的多孔板及板夾臺。

Hayes的于1998年12月15日出版的美國專利5,849,208描述多種反應室和多種分析室,其中使用盒來保存用于PCR和后續分析的生物材料。

Astle的于2003年10月14日出版的美國專利6,632,653教導了一種PCR裝置,其用指標化步驟在連續基礎上以獨特的溫度變化順利指示試劑多孔板的模式。

Sudor的于2004年3月23日出版的美國專利6,709,692描述了一種利用表面處理聚合物對表面的處理,以及在這類表面上進行流體操作(包括PCR)的方法。表面包括諸如試管、多孔板、移液管和毛細管的裝置的表面。

Atwood的于2006年11月7日出版的美國專利7,133,726教導了一種裝置(其將樣品循環通過一系列溫度偏移)、蓋子和控制該過程的計算機。

發明概述

進行聚合酶鏈式反應的方法,包括將含有聚合酶鏈式反應的反應物的液體運輸通過聚合管道,所述聚合管道被設置為通過第一反應循環區域和至少第二反應循環區域,所述每個區域包括第一和第二,或第一、第二和第三溫度帶,所述第二區域中每個帶的溫度與所述第一區域中相應帶的溫度基本相同,其中所述液體是含有聚合酶鏈式反應的反應物和表面吸附聚合物的水溶液。

需要連續熱循環儀,其被設計成能大量產生DNA鏈,能容易地適應不同的PCR反應要求,并且能夠有效運轉。

本發明提供用于能夠批量產生DNA鏈的連續熱循環系統的方法,所述熱循環系統是有效的、可擴展的、容易適應不同的PCR反應要求并且相對便宜的產生。本發明的實施方案在溫度控制體內具有多種溫度控制扇區,從而產生多種溫度帶。流體優選的通過路徑流過裝置或沿著裝置流動,從而流過不同的溫度帶或沿著不同的溫度帶流動。

本發明的優選實施方案特別地適合于快速、容易和大量地擴增DNA片段。因此利用本發明可以有效使大量產生DNA的速率大大高于常規的DNA產生率。本發明的低制造成本和增強的可擴展性允許大量DNA的相對廉價的連續擴增。特別地,本發明的優選實施方案包括具有12個餅狀或楔形扇區的單個圓柱狀溫度控制體,每個扇區具有用于獲得所需溫度的裝置,并且每個扇區與其他扇區通過熱障分隔。具溝通道沿著所述溫度控制體的外表面環繞或盤旋,并且置于所述通道內或所述通道上的一段的管道將DNA擴增反應物循環地從一個扇區輸送到后續扇區。因此反應物以循環方式暴露于不同的溫度帶,最終引起DNA的擴增。用于移動反應物的裝置確定反應物通過一段管道的流速,從而基于特定反應物的特性優化經由PCR的擴增??梢詫⑷我鈹的康纳葏^并入溫度控制體,這只需簡單的將其分成增加的扇區或減少所述扇區的數目。此外,通過添加分層扇區和/或利用具有非圓柱形(諸如具有橢圓形橫截面)的溫度控制體,可以在溫度控制體中并入進一步的適應性。

附圖簡述

參照附圖描述本發明。在附圖中,類似的附圖標號表示相同或功能類似的元件。

圖1是本發明熱循環系統的一個實施方案的正視圖。

圖2是圖1的熱循環系統的平面圖。

圖3A是本發明熱循環系統的可選擇實施方案的正視圖。

圖3B是圖3A的熱循環系統的外表面一部分的展開圖。

圖3C是圖3A的熱循環系統的通道一部分的展開圖。

圖4是圖1的熱循環系統的正視圖,顯示絕緣層基本上環繞溫度控制體。

圖5是圖1的熱循環系統的俯視圖。

圖6是圖1的熱循環系統的溫度控制體的透視圖,顯示絕緣層的一部分。

圖7是圖1的熱循環系統的溫度控制體的俯視圖。

圖8是圖1的熱循環系統的溫度控制體的底視圖。

圖9是本發明熱循環系統的可選擇實施方案的正視圖。

圖10是圖9的熱循環系統的俯視圖。

圖11是圖9的熱循環系統的底視圖。

圖12是圖9的熱循環系統的頂蓋的平面圖。

圖13是圖9的熱循環系統的底蓋的平面圖。

圖14是電泳凝膠照片,顯示與常規系統的效率進行比較的本發明熱循環系統的一個實施方案的效率。

圖15是冷卻組件的分解透視圖。

圖16是冷卻組件的近攝透視圖(closed?perspective?view)。

圖17是與熱循環儀連接的冷卻組件的透視圖。

發明詳述

用于本發明的聚合管特別地包括合成的樹脂含氟聚合物管,諸如柔性聚四氟乙烯(PTFE)或TEFLON牌管。對于圓橫截面來說,合適的大小可以是外徑為約1/8英寸,以便適合通道104,如果該通道寬大約1/8英寸。管道壁可以是約5/1000英寸,內徑為約1/32英寸或更大。對于任選的熱傳導,內徑應當低于約1/8英寸。管道的橫截面還可以是橢圓、正方形或矩形的。供應商包括Orangeburg,SC的Zeus?Industrial?Products和FallRiver?MA的Oxidation?Systems?Inc。

用于本發明的表面吸附聚合物包括美國專利6,709,692中描述的那些,特別地,氧化乙烯和環氧丙烷的嵌段共聚物,諸如Florham?Park,NJ的BASF用PLURONIC(普朗尼克)商標提供的那些。實例包括F108、F108NF、F68和F127。

表面吸附聚合物(諸如聚環氧乙烷/聚環氧丙烯嵌段共聚物)的量可以在約1.5毫克每毫升到100毫克每毫升的范圍。普遍認為相對于未經處理的管道,所述聚合物使管道表面對反應物更加惰性,并且防止Taq酶失活。該結論基于以下觀察,在無表面吸附聚合物的情況下PCR試劑流過20英寸或更厚的PFTE管道后擴增被有效抑制。但是,當從該管道收集PCR試劑時,通過向試劑回添新的Taq聚合酶,所述試劑可以被再活化用于常規模塊熱循環儀中的DNA擴增。這表明因為接觸管道而損失或失活的單一關鍵組分是Taq?DNA聚合酶。當混合物中包含表面吸附聚合物時,DNA擴增進行的水平與傳統模塊熱循環儀相同或比其更高。此外,通過用含有約1.5-3.5%(w/v)的表面嵌段聚合物(諸如普朗尼克F108)的水溶液預沖洗管道,可以使用不含表面嵌段聚合物作為試劑的擴增混合物進行成功擴增,這樣的話最后對純化的要求更低,但是這不如包含所述聚合物作為PCR試劑之一時那么有效。本發明的另一部分是進行聚合酶鏈式反應的方法,其包括以下步驟:(a)將含有表面吸附聚合物的水溶液輸送通過聚合管道,繼之以;(b)在足以引起所述聚合酶鏈式反應的溫度將含有聚合酶鏈反應物的第二水溶液運輸通過所述管道。在所述裝置從產生一種特定DNA轉換為產生另一種之前,通常用10%漂白劑清洗再用去離子水充分洗滌來清潔本發明方法中使用的管道。在所述裝置用于進一步的DNA合成之前,可以用表面吸附聚合物(諸如普朗尼克)洗滌來預處理清潔的管道,本發明的一個優點是在反應合成操作期間對管道的連續處理和條件化,從而減少了關閉模式下耗費的時間。因此,添加的聚合物的量是足以維持管道條件化并防止DNA合成期間反應酶諸如Taq失活的量。這可以通過觀察添加到反應物溶液中的聚合物的量(使溶液稍微渾濁)來確定。認為這是在Taq周圍產生微膠粒(即聚合物的外層)的點。這與使用油類和油/水乳液反應物系統完全不同。

當根據本發明實施時,用于PCR三個步驟的溫度分別為大約95℃、57℃和72℃。但是,為了增加反應的特異性和產量,溫度可以變化。

本發明涉及用于在單個物理結構內同時維持多個溫度區域的方法和組成。因此本發明特別地適合于在物質的自動熱循環中使用,諸如用于核酸序列的擴增。參照附圖,特別地參照圖1-13,本發明的熱循環系統100優選的包括具有至少兩個扇區118和路徑104的溫度控制體102,所述路徑104循環地從一個起始扇區118依次通到每個后續的扇區118,然后返回所述的起始扇區118,并按照需要的次數循環重復從一個扇區118通到下一個扇區118。路徑104跨過扇區118,其沿著溫度控制體102的外表面132從一個扇區118通到各后續扇區118,通過內部地鉆過扇區118從一個扇區118到各后續的扇區118,或通過這類外部或內部行進的組合。

每個扇區118都包含至少一個改變或獲得溫度的裝置120。所述變溫裝置120能夠實現并維持特定的所需溫度。因此變溫裝置120優選的是加熱器,冷卻器,Peltier裝置,熱泵,恒溫箱,火室,熱反應室,或類似裝置。每個扇區118優選的基本上由鋁、鋁合金、金屬、金屬合金、熱導體、不對稱熱導體或其組合制成。變溫裝置120從而加熱、冷卻或維持扇區118的溫度,以致位于每一扇區118內或扇區118上的路徑104部分被類似地加熱、冷卻或維持在該扇區118的特定溫度。

各個扇區118還優選的與其他扇區118被位于所述扇區118之間的熱障122分隔。熱障122可以是被動的,可以包括熱絕緣體、空氣、氣體、液體、固體和/或其組合??蛇x擇地或此外,熱障122可以是主動裝置或物質(諸如Peltier裝置),其能夠維持明顯的溫度差異。因此每個扇區118作為獨立的溫度槽,其中該扇區118的變溫裝置120實現并維持整個扇區118的所需溫度,而熱障122將每個扇區118與其他扇區118熱分離。從而有效地在單體內實現并維持多個溫度區域。絕緣層124可以任選的基本上環繞溫度控制體102,從而將扇區118和周圍環境之間的熱轉移降到最低。

溫度控制體102可以具有任何需要的形狀,諸如圓柱形,圓錐形,三角形,矩形,金字塔形,多角形,塊形或立方形。扇區118可以具有任何符合溫度控制體102的剖面、部分或小塊的所需形狀。例如,扇區118可以是楔形、弧形或扇形,或具有圓柱形、圓錐形、三角形、矩形、金字塔形、多角形、塊形或立方形的扇形部分的形狀。扇區118也可以是分層的,一個在另一個的頂上。所需扇區118可以以任意數目存在。所有扇區118可以是相同大小,或一個或多個扇區118可以是不同大小。

熱循環系統100還優選的包括多個溫度傳感器130。每個扇區118優選的具有一個或多個溫度傳感器130,其位于該扇區118內或附近,以測量該扇區118或扇區118的一部分的溫度。每個溫度傳感器130產生溫度輸出值,其直接或間接代表該扇區118的溫度。這類溫度傳感器130可以是任意測定溫度的常規裝置??梢匀芜x的將這類溫度傳感器130置于絕緣層124內或絕緣層124上。

熱循環系統100還優選的包括調溫裝置134。調溫裝置134調節各個變溫裝置120,以致在各個扇區118內實現所需溫度??梢允褂萌我鈹的康恼{溫裝置134來調節變溫裝置120。調溫裝置134優選的包括恒溫器。在一個實施方案中,執行軟件程序的計算機系統與變溫裝置120和溫度傳感器130聯通,其中所述軟件使用為每個扇區118預設的目標溫度來控制和調節變溫裝置120。所述目標溫度由預期應用和使用的熱循環系統100確定,在一個優選的實施方案中該系統是PCR。所述軟件接收來自溫度傳感器130的溫度值輸出。每個所述溫度值直接或間接代表扇區118的溫度。所述軟件將各扇區118的溫度值輸出與該扇區118預設的目標溫度進行比較。然后,如果從溫度傳感器130接收的溫度輸出值超過或低于最小預定值,所述軟件將啟動該扇區118的一個或多個變溫裝置120以增加或減少該扇區118或該扇區118適當部分的熱量。也就是說,根據溫度傳感器130的值和位置,該系統可以啟動扇區118中變溫裝置的全部或一部分??蛇x的,可以使用調溫裝置134,諸如任何常規恒溫系統。

熱循環系統100還優選的包括使流體128沿著路徑104移動的裝置106。因此流體128循環地從一個扇區118流到另一個扇區118,并且流體128的溫度與其穿過或于其上流動的扇區118的溫度平衡。因此當流體128沿著路徑104流動時,其溫度循環變化。流體128優選的包括任何熱依賴性反應混合物、反應物或試劑。流體移動裝置106優選的包括泵,諸如蠕動泵、壓縮氣體系統或類似裝置。例如,可以使用加壓氦氣系統沿著路徑104推動流體128。

用于移動反應混合物通過所述系統的泵包括以下類型的泵:蠕動泵、腔式泵、離心泵、活塞泵、羅茨增壓泵、旋轉葉片泵、隔膜泵、注射泵和齒輪泵。注射泵由Holliston,Massachusetts的KD?Scientific提供,其通常被設置提供從供應管通過管道而進入反應區的脈動性連續液流,其不接觸推動液體運動的注射器,該注射器只接觸作為液壓流體的水。例如,2個注射器可以是180°異相,以致當一個充滿水時,另一個傾空其水以推動反應物液體進入并通過DNA合成裝置??梢越佑|反應物液體的可選擇泵是旋轉活塞泵,其使用對反應物沒有影響的陶瓷活塞和圓柱。實例包括由North?Springfield,Vermont的IVEK?Corporation供應的那些。

在熱循環系統100的特定實施方案中,溫度控制體102是單個基本上為圓柱的體,其具有多個基本上扇形或楔形的扇區118。路徑104包括在溫度控制體102的外表面132周圍環繞或盤旋的具溝通道。在該具溝通道內或沿著該具溝通道放置一段管道126。根據特定熱依賴性反應的特性和要求確定各扇區118的所需溫度。調溫裝置134和變溫裝置120被激發,以致達到各扇區118的所需溫度。

溫度傳感器130測量各扇區118的實際溫度,酌情激發或關閉各變溫裝置120以達到并維持各扇區118的所需溫度。流體移動裝置106移動或推動流體128通過一段管道126。因此流體128在循環基礎上經歷一系列不同的溫度區域,最終導致流體128向一個或多個產物的轉化或反應。任選的溫度控制體102可以附著于支持基質上。用于轉動溫度控制體102的裝置也可以任選的用于便于將一段管道126置于具溝通道內或沿著具溝通道放置。這類轉動裝置可以包括具有輪子和齒輪部件的電動機或類似替代性裝置。

熱循環系統100特別地適合于通過PCR的DNA大規模擴增。因此,熱循環系統100的特定實施方案含有具溝通道路徑104,其環繞單個圓柱狀溫度控制體102的外表面132。因此,該通道具有鄰近溫度控制體102的頂部邊緣110的第一末端114和鄰近溫度控制體102的底部邊緣112的第二末端116。溝的深度是任意的,并且可以取決于一段管道126(可以置于溝內或沿著溝放置)的直徑和/或可以取決于熱循環系統的特定應用。圓柱狀溫度控制體具有12個相同大小的弧形扇區118,每個扇區118都具有一個變溫裝置120。每個扇區118都具有一個溫度傳感器130(具體來說是K型熱電偶),內置于扇區118中。流體移動裝置106(優選的是加壓氦氣系統)使流體128流過一段管道126。流體128優選的包括待擴增的DNA鏈,兩條引物和熱穩定的Taq聚合酶。此外,流體128中還包含有利于通過PCR擴增DNA的物質。優選的單個調溫裝置134調節每個變溫裝置120。流體移動裝置106使流體128從扇區118移到扇區118,以致通過PCR的DNA擴增被優化。

在熱循環系統100的一個實施方案中,圓柱狀溫度控制體102被分成3個相等的扇形扇區118,圍繞該圓柱的通道有約30到約40個“圈(turns)”,特定數目為約33個圈。通道的每個“圈”是流體128圍繞圓柱的外表面132圓周流動的一個“循環”。此外,該通道內的管道126(諸如PTFE管道或TEFLON管道或合成樹脂含氟聚合物管道)被3個絕緣層124(每個扇區118一個)圍繞,其中每個絕緣層124具有8個溫度傳感器130。蠕動泵106被置于距離管道126延伸離開圓柱的底112的點約6到約7英寸處。利用裝置的這種布置,使用本裝置的優選方法以45秒每部分118(溫度帶)的速率推動流體128通過管道126,導致約135秒每循環的流速(管道126圍繞圓柱1“圈”)。

扇區/溫度帶118施加在試劑上的溫度和循環次數優選的符合公知的和現有的PCR方法。用于連續熱循環系統的本裝置和方法的優選用途是擴增DNA,但本發明的該用途只是為了方便的目的。在需要連續加熱或冷卻流體128通過多個溫度帶的不同應用中使用本發明的裝置和方法,這對于相關領域的普通技術人員來說是顯而易見的。

可以在將流體128引入一段管道126之前,大批量混合或產生流體128,或在即將將其引入一段管道126前,及時或快速地產生流體128。流體128優選的是基本上均質的溫度依賴性反應混合物,并且優選的存在通過一段管道126的連續供應這類流體128??梢允褂每刂屏黧w128引入的裝置,諸如計算機系統和軟件程序。所述軟件程序優選的使用用于確定正確混合(通過比例)、相繼次序和向一段管道126內輸入流體128和/或流體組分的時間的預定實驗步驟。在一個實施方案中,根據特定的PCR要求確定引入流體128組分的實驗步驟??梢允褂靡肓黧w128的任意裝置,諸如本領域技術人員已知的泵閥管線或網絡。

通過常規方法收集從管道末端獲得的流體128輸出物。在一個優選實施方案中,所獲流體包含擴增的DNA。此外,顯而易見本發明的裝置和方法將提供擴增DNA的連續供應,只要泵按照本文所述通過所述裝置補充流體組分。然后可以從反應混合物中分離DNA,諸如去除表面吸附聚合物,諸如其中的嵌段共聚物。

本發明的方法用于促進需要周期性溫度變化的化學反應,因此包括激發熱循環系統100上的變溫裝置120,所述熱循環系統100具有輸送流體的裝置諸如沿著路徑104延伸的一段管道126,將基本上同質的溫度依賴性反應混合物引入輸送裝置,激發移動裝置106,以致反應混合物穿過輸送裝置并且反應混合物發生反應形成產物,以及在輸送裝置的末端收集產物。所述化學反應優選的是聚合酶鏈式反應。該方法任選的還包括在輸送裝置的一個末端連續補充流體。

用于連續調節流體溫度的裝置,包括:含有至少兩個扇區、外表面、頂部邊緣、底部邊緣、每個所述扇區內的至少一個溫度控制裝置和所述外表面中的通道的圓柱,其中所述通道具有第一末端和第二末端,并且其中所述通道圍繞所述外表面盤旋;一部分管道具有第一末端、第二末端和一段長度,所述管道置于所述通道內,其中所述管道的所述第一末端自所述通道的所述第一末端延伸,并且所述管道的所述第二末端自所述通道的所述第二末端延伸;用于將流體分配入所述管道的所述第二末端的裝置;與所述管道聯通的移動裝置,其中所述移動裝置使所述流體通過所述管道從所述管道的所述第二末端移動到所述管道的所述第一末端;當所述流體流過所述管道穿過所述圓柱的每個所述扇區時,測定所述管道溫度的裝置;和用于調節所述一個或多個溫度控制裝置的裝置,其中所述調節裝置與所述測定裝置聯通。

在該裝置中,所述通道的所述第一末端在鄰近所述圓柱的所述頂部邊緣終止,所述通道的所述第二末端在鄰近所述圓柱的所述底部邊緣終止。

用于促進需要周期性溫度變化的化學反應的方法,所述方法包括以下步驟:(a)激發熱循環系統上的變溫裝置,其中所述熱循環系統包括:包括至少兩個扇區、外表面和循環地穿過所述扇區的路徑的溫度控制體,其中每個所述扇區包括至少一個所述變溫裝置;輸送流體的裝置,其中所述輸送裝置沿著所述路徑延伸;以及與所述輸送裝置聯通的移動裝置,其中所述移動裝置適宜使所述流體移動通過所述輸送裝置;(b)將基本上均質的溫度依賴性反應混合物引入所述輸送裝置;(c)激發所述移動裝置,以致所述反應混合物穿過所述輸送裝置,并且以致所述反應混合物反應形成產物;和(d)在所述輸送裝置的第一末端收集所述產物。

圖15、圖16和圖17顯示可以用于本發明的液體冷卻組件。所述冷卻組件是連續PCR熱循環儀的附加裝置,其增加熱負荷,可以被置于熱循環儀的熱反應圓柱上,從而增加其中所含流體的流速或者體積以更快的產生特定DNA結構。通過對該裝置實施方案進行的實驗,已經觀察到多至60℃的降溫。這使熱循環儀的流體體積增加4倍,等于產生速度增加4倍。

液體冷卻組件134由鋁組件組成,該鋁組件由兩塊板136和138制成,這兩塊板用螺釘140擰接在一起并用墊圈142密封。提供輸入和輸出口144和146,以便冷卻液流過組件134。在操作期間,所述組件被附著到加熱的圓柱溫度控制體102的側面,所述溫度控制體102在其外表面圍繞有螺紋,并按照環狀排列被分成24個部分150。每個部分的溫度可以被獨立設置。組件134中每個部分具有相同的寬度和高度。管道沿著置入表面的螺紋環繞圓柱,而所述組件被附著到必須發生明顯降溫的部分。用于PCR的DNA試劑流過管道(該管道沿著圍繞圓柱外周的螺旋路徑),當它們穿過每個部分時被加熱或冷卻。當所述試劑達到組件時,它們在組件134的圓柱部分和外表面進行加熱。當所述試劑進入下一個部分時,它們非常接近于該部分的溫度。為了從圓柱散熱,所述組件具有貫穿其的盤旋通道148,所述通道148載有高流速的流體冷卻劑。這些盤旋設計在冷卻劑內產生渦流,從而增加組件與冷卻劑間的熱轉移。一旦冷卻劑穿過組件,其通過端口146從系統排出??梢詫⒗鋮s劑收集到冷卻器中進行冷卻并再次穿過系統,或被永久排出。

實施例1

制備樣品,其包含:12%MgCl2(25mM),0.33%Taq?DNA聚合酶(5單位/μl),2.0%dNTPs(三磷酸脫氧腺苷(dATP),三磷酸脫氧胞苷(dCTP),三磷酸脫氧鳥苷(dGTP)和三磷酸脫氧胸苷(dTTP)),8.0%模板(2μg/ml),61.66%普朗尼克F108溶液(1.5%溶液),4%正向引物,4%反向引物,8%反應緩沖液(10×濃度)。利用這些數字可以將溶液擴充至恰當的體積。圓柱狀溫度控制體102的12個垂直扇區118被加熱到3種不同溫度,4個相鄰扇區118被加熱到95℃,另一4個相鄰扇區118被加熱到59℃,和最后4個相鄰扇區118被加熱到72℃。內徑(ID)1/32″、外徑(OD)1/16″的TEFLON?PTFE管道環繞溫度控制體102共30次,使一段管道126和反應混合物連續經歷3種不同溫度共30次。然后利用20PSI的增壓容器推動該反應混合物通過該管道126。在將反應混合物提供給溫度控制體102后,使用礦物油推動樣品通過管道126的全長。用流量閥將反應混合物的流速控制為0.25ml/分鐘。當特定DNA序列循環通過所述溫度帶時,樣品中存在的特定DNA序列(其界限由寡核苷酸引物確定)被擴增。第30個循環后,管道126退出圓柱102,收集內容物。樣品在Cambrex?ReliantPrecast?2%瓊脂糖凝膠上進行分析并用溴化乙錠染色。

利用BIORad?Geldoc?EQ系統獲得凝膠圖像,顯示于圖14。各泳道的內容物如下:泳道1,空;泳道2,分子量梯度物(ladder);泳道3,無模板陰性對照(樣品A);泳道4,空;泳道5,在熱系統100的實施方案中擴增的樣品(樣品B);泳道6,空;泳道7,在熱循環系統100的實施方案中擴增繼之以在常規Perkin?Elmer?480裝置中擴增的樣品(樣品C);泳道8,空;泳道9,用常規Perkin?Elmer?480裝置運行的陽性對照樣品(樣品D);泳道10,分子量梯度物;泳道11,空;和泳道12,空。

利用ImageJ?1.33u版軟件分析圖像,其中提取強度數據以獲得積分強度及包括扣除本底的計算值,不進行其他標準化。樣品A的條帶強度是0.07,樣品B的條帶強度是3.62,樣品C的條帶強度是3.77,和樣品D的條帶強度是3.19。

這些數據表明本發明的系統和方法即使不比標準商品化系統的實例(Perkin?Elmer?480裝置)更有效,也與其一樣有效。制備3種相同的反應混合物,一個樣品以其無模板的未擴增形式被檢測(樣品A),一個樣品用本發明的系統運行(樣品B),一個樣品先用本發明的系統運行再用常規商品化系統運行(樣品C),和一個樣品用常規商品化系統運行(樣品D)。凝膠上目標質量(300bp)處條帶的強度是產生的DNA產物數量的指標。

樣品C產生最強的條帶,但是它并不比單獨用本發明產生的樣品強很多。因為樣品C經歷熱循環系統100實施方案的30個循環,然后經歷商品化系統的30個循環,如果離開本發明使用的裝置后仍然剩余活性試劑,則可以合理預期一些額外的擴增。

樣品B(利用本發明使用的裝置產生的DNA)產生第二強的條帶。包括樣品D是為了顯示從常規商品化系統Perkin?Elmer系統預期的DNA的相對量。來自該商品化系統的條帶(樣品D)的強度要低于來自本發明的所述系統和方法的條帶(樣品B)。這表明本發明使用的系統和方法的效率等于或高于該商品化系統。樣品A用于指示在經歷擴增條件(在Perkin?Elmer商品化系統中)但無模板DNA的系統中沒有觀察到DNA(或可忽略量的信號),并且在反應溶液中沒有污染物(其可能被誤解為擴增)。該數據的重要特征是樣品B條帶比在常規系統中實施的相同反應更強(指示更好的反應)。

實施例2

通過將3%重量/體積的普朗尼克F127與水混合并將其添加到PCR反應混合物中構建含普朗尼克的反應混合物,得到下列濃度:

??試劑 ??母液濃度 ??最終溶液% ??MilliQ水 ??79.9% ??普朗尼克F127溶液 ?向水中添加3%粉末溶解,?輕微增加體積 ??3% ??PCR緩沖液(匹配制造商的酶) ?10× ??10% ??pGEM?3ZF+質粒 ?5毫克/毫升 ??0.06% ??MgCl2 ?150毫摩 ??2% ??正向引物??CGATTTCGGCCTATTGGTTA ?20微摩 ??2% ??反向引物??CGGTGAAAACCTCTGACACA ?20微摩 ??2% ??Taq?DNA聚合酶 ?5單位/微升 ??0.6% ??脫氧核苷酸混合物 ?每核苷酸10微摩 ??2% ??100%

在泵入所述裝置前及收集后,均低溫保存PCR混合物。所述裝置使用30圈的PFTE管道,其內徑(ID)為1/16英寸,外徑(OD)為1/8英寸。將PCR混合物體積補足500ml,循環前在4攝氏度保存。該實施例中,所述裝置的扇區被等分成12個扇區。前4個扇區被加熱到95攝氏度,接下來4個扇區被加熱到58攝氏度,最后4個扇區被加熱到72攝氏度。維持泵的流速,以致流體用33秒流過4個扇區,管道每個順序圈共用99秒,溶液第一次完全穿過管道共用2970秒。

實施例3

描述普朗尼克的濃度范圍,利用如實施例2所述的相同DNA模板、寡核苷酸引物和溫度/流動濃度及含普朗尼克F108的反應混合物,所述反應混合物通過將1.5%重量/體積的普朗尼克F108與水混合并將其與適量MilliQ水添加到PCR反應混合物中使終體積到100%而制備。

??試劑 ??母液濃度 ??最終溶液% ??MilliQ水 ??64%-0% ??普朗尼克F108 ??向水中添加1.5%粉末溶解 ??8%-72% ??PCR緩沖液(匹配制造商的酶) ??10× ??8% ??pGEM?3ZF+質粒 ??0.1毫克/毫升 ??8% ??MgCl2 ??25毫摩 ??12% ??正向引物??CGATTTCGGCCTATTGGTTA ??10微摩 ??4% ??反向引物??CGGTGAAAACCTCTGACACA ??10微摩 ??4% ??Taq?DNA聚合酶 ??5單位/微升 ??0.33% ??脫氧核苷酸混合物 ??每核苷酸10微摩 ??2% ??100%

在泵入所述裝置前及收集后,均低溫保存PCR混合物。所述裝置使用30圈的PFTE管道,其內徑(ID)為1/16英寸,外徑(OD)為1/8英寸。將PCR混合物體積補足至50ml,循環前在4攝氏度保存。該實施例中所述裝置的扇區被等分成12個扇區。前4個扇區被加熱到95攝氏度,接下來4個扇區被加熱到58攝氏度,最后4個扇區被加熱到72攝氏度。維持泵的流速,以致流體用33秒流過4個扇區,管道每個連續圈共用99秒,溶液第一次完全穿過管道共用時2970秒。

實施例4

該實施例描述使用1.5%普朗尼克溶液清洗1次裝置中的管道,時間范圍為30分鐘到60分鐘以預處理該管道,然后泵入不含普朗尼克或其他表面吸附聚合物的PCR試劑混合物。該實施例使用實施例2的反應混合物中相同的DNA模板、寡核苷酸引物和溫度/流動濃度。

??試劑 ??母液濃度 ??最終溶液% ??MilliQ水 ??62%-0% ??PCR緩沖液(匹配制造商的酶) ??10× ??8% ??pGEM?3ZF+質粒 ??0.1毫克/毫升 ??8% ??MgCl2 ??25毫摩 ??12% ??正向引物??CGATTTCGGCCTATTGGTTA ??10微摩 ??4% ??反向引物??CGGTGAAAACCTCTGACACA ??10微摩 ??4% ??Taq?DNA聚合酶 ??5單位/微升 ??0.33% ??脫氧核苷酸混合物 ??每核苷酸10微摩 ??2% ??100%

在泵入所述裝置前及收集后,均低溫保存PCR混合物。所述裝置使用30圈的PFTE管道,其內徑(ID)為1/32英寸,外徑(OD)為1/16英寸。將PCR混合物體積補足至10ml,循環前在4攝氏度保存。該實施例中所述裝置的扇區被等分成12個扇區。前4個扇區被加熱到95攝氏度,接下來4個扇區被加熱到58攝氏度,最后4個扇區被加熱到72攝氏度。維持泵的流速,以致流體用33秒流過4個扇區,管道每個連續圈共用99秒,溶液第一次完全穿過管道共用時2970秒。

實施例5

如下構建75毫升的反應混合物。將裝置預設為按以下溫度和時間運行:95攝氏度30秒,56攝氏度30秒和72攝氏度45秒,共36個循環。流速為0.222813ml/分鐘。在合適大小的聚丙烯容器內制備PCR反應混合物,通過顛倒(無需渦旋)進行混合。移出50微升的等分試樣用作無模板對照。

??試劑 ??母液濃度 ??最終溶液% ??MilliQ水 ??75.3% ??普朗尼克F108 ??2.5%粉末質量/體??積,溶于MilliQ水 ??6% ??PCR緩沖液(Nature?Technologies) ??10× ??10% ??pGEM?3ZF+質粒pGEM?3ZF+DNA??插入物范圍從0到1200bp的質粒 ??100ng/毫升 ??0.06% ??MgCl2 ??25微摩 ??2% ??正向引物??5’AAAGGGAATAAGGGCGACAC3’ ??10微摩 ??2% ??反向引物??5’CCTGATGCGGTATTTTCTCC3’ ??10微摩 ??2% ??Nature?Technologies的Taq?DNA聚合??酶 ??5單位/微升 ??0.7% ??脫氧核苷酸混合物 ??每核苷酸10微摩 ??2% ??100%

在泵入所述裝置前及收集后,均低溫保存PCR混合物。所述裝置使用36圈的PFTE管道,其內徑(ID)為1/16英寸,外徑(OD)為1/8英寸。將PCR混合物體積補足至250ml,循環前在4攝氏度保存。該實施例中所述裝置的扇區被等分成24個扇區。前6個扇區被加熱到95攝氏度,接下來6個扇區被加熱到56攝氏度,最后10個扇區被加熱到72攝氏度。維持泵的流速,以致流體用105秒流過管道的每個連續圈,溶液第一次完全穿過管道共用時3780秒。冷卻扇區被用于裝置的被設為56攝氏度的第一個6個扇區。自來水流過冷卻扇區以便散熱并且更快的將溶液從95攝氏度降到56攝氏度。在多次使用之間,該裝置的管道用10%漂白劑或商品化PCR清潔劑諸如Bleachrite清洗,并在多次使用之間用MilliQ水清洗。通過膜濾法和乙醇沉淀,從樣品中去除核苷酸和引物后,該實驗中475個堿基對DNA擴增子的產量是1263微克。

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