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植物耐旱相關蛋白AtDi19及其編碼基因與應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201010219697.3

申請日:

20100628

公開號:

CN102295689B

公開日:

20131113

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:

IPC分類號:

C07K14/415,C12N15/29,C12N15/63,C12N1/15,C12N1/19,C12N1/21,C12N5/10,C12N15/11,A01H5/00

主分類號:

C07K14/415,C12N15/29,C12N15/63,C12N1/15,C12N1/19,C12N1/21,C12N5/10,C12N15/11,A01H5/00

申請人:

中國農業大學

發明人:

武維華,劉文馨,陳益芳,鄒俊杰,張文正

地址:

100193 北京市海淀區圓明園西路2號

優先權:

CN201010219697A

專利代理機構:

北京紀凱知識產權代理有限公司

代理人:

關暢;任鳳華

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內容摘要

本發明公開了一種植物耐旱相關蛋白AtDi19及其編碼基因與應用。本發明提供的蛋白質,是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質;(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐旱性相關的由序列1衍生的蛋白質。本發明提供了擬南芥中參與植物抗旱反應的蛋白和基因,對于進一步闡明植物抗旱的分子機理并通過基因工程的技術和手段培育優質、抗旱的作物新品種具有重要的理論意義和現實意義。

權利要求書

1.一種培育轉基因植物的方法,是將編碼序列表中序列1所示蛋白的基因導入目的植物中,得到耐旱性高于所述目的植物的轉基因植物;所述植物為擬南芥。2.如權利要求1所述的方法,其特征在于:所述基因為序列表中序列2所示的DNA分子。3.如權利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述基因通過重組表達載體導入所述目的植物中;所述重組表達載體為將所述基因序插入pCAMBIA1300:Super的XbaI和KpnI酶切識別位點之間得到的重組質粒;所述pCAMBIA1300:Super為在pCAMBIA1300的HindIII和XbaI酶切位點之間插入序列表的序列3所示的DNA得到的重組質粒。4.一種培育轉基因植物的方法,是將編碼序列表中序列1所示蛋白的基因導入目的植物中,得到失水率低于所述目的植物的轉基因植物;所述植物為擬南芥。5.如權利要求4所述的方法,其特征在于:所述基因為序列表中序列2所示的DNA分子。6.如權利要求4或5所述的方法,其特征在于:所述基因通過重組表達載體導入所述目的植物中;所述重組表達載體為將所述基因序插入pCAMBIA1300:Super的XbaI和KpnI酶切識別位點之間得到的重組質粒;所述pCAMBIA1300:Super為在pCAMBIA1300的HindIII和XbaI酶切位點之間插入序列表的序列3所示的DNA得到的重組質粒。

說明書

技術領域

本發明涉及一種植物耐旱相關蛋白AtDi19及其編碼基因與應用。

背景技術

糧食問題是當今世界所面臨的幾大難題之一。植物在生長發育過程中,常遭受許多非生物逆境如干旱、鹽漬、低溫等的影響,其中干旱是影響植物品質和產量的重要限制因素。世界干旱、半干旱區占地球陸地面積的三分之一,我國干旱、半干旱地區約占國土面積的二分之一。干旱不僅嚴重影響植物的生長發育,造成農作物減產,并且使生態環境日益惡化,因此提高作物的抗旱能力對農業生產及生態環境保護具有重要的意義。

在長期的進化過程中,高等植物逐漸演變產生了一套感受和傳導干旱脅迫信號的系統,并形成一系列生理或發育的機制來響應環境中的干旱脅迫,最大限度地減輕干旱脅迫造成的傷害。利用現代分子生物學、植物生理學等技術手段研究植物抗旱的分子機理,發現和挖掘抗逆性基因和轉基因技術的不斷完善,為培育高效抗旱作物新品種開創了一條嶄新的途徑。對植物抗旱的分子機理研究及抗旱品種的培育成為當前研究的熱點。

擬南芥(Arabidopsis?thaliana)是一種典型的雙子葉模式植物,具有個體小、生長周期短、遺傳背景簡單清楚、易被誘變等特點,已成為植物科學研究的模式材料。廣泛應用于植物遺傳學、發育生物學和分子生物學的研究,擬南芥的大多數基因在其他植物中都能找到同源基因,在擬南芥研究中發現對植物生長發育具有重要作用的基因也可直接應用到其它植物研究中。擬南芥基因組大小為125Mbp,約2.7萬個基因,目前仍然還有許多基因的功能不十分清楚。

發明內容

本發明的目的是提供一種植物耐旱(抗旱)相關蛋白AtDi19及其編碼基因與應用。

本發明提供的蛋白質名稱為AtDi19,(Drought-induced),來源于哥倫比亞生態型擬南芥,是如下(a)或(b):

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質;

(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐旱性相關的由序列1衍生的蛋白質。

序列1所示蛋白質由206個氨基酸殘基組成。

為了使(a)中的AtDi19便于純化,可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。

表1??標簽的序列

??標簽 ??殘基 ??序列 ??Poly-Arg ??5-6(通常為5個) ??RRRRR ??Poly-His ??2-10(通常為6個) ??HHHHHH ??FLAG ??8 ??DYKDDDDK ??Strep-tag?II ??8 ??WSHPQFEK ??c-myc ??10 ??EQKLISEEDL

上述(b)中的AtDi19可人工合成,也可先合成其編碼基因,再進行生物表達得到。上述(b)中的AtDi19的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子,和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變,和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。

編碼所述蛋白的基因也屬于本發明的保護范圍。

所述基因可為如下1)或2)或3)的DNA分子:

1)序列表中序列2所示的DNA分子;

2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼耐旱性相關蛋白的DNA分子;

3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼耐旱性相關蛋白的DNA分子。

上述嚴格條件可為在6×SSC,0.5%SDS的溶液中,在65℃下雜交,然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。

序列表中的序列1由621個核苷酸組成,其開放閱讀框架(ORF)為自5′末端第1至621位核苷酸。

含有所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的保護范圍。

可用現有的植物表達載體構建含有所述基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區域,即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構建重組植物表達載體時,在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子,它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用;此外,使用本發明的基因構建植物表達載體時,還可使用增強子,包括翻譯增強子或轉錄增強子,但必需與編碼序列的閱讀框相同,以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的,可以是天然的,也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選,可對所用植物表達載體進行加工,如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因、具有抗性的抗生素標記物或是抗化學試劑標記基因等。從轉基因植物的安全性考慮,可不加任何選擇性標記基因,直接以逆境篩選轉化植株。

所述重組表達載體具體可為Super:AtDi19。所述Super:AtDi19為將權利要求2所述基因插入pCAMBIA1300:Super的多克隆位點得到的重組質粒。所述Super:AtDi19優選為將序列表的序列2所示的DNA片段插入pCAMBIA1300:Super的XbaI和KpnI酶切識別位點之間得到的重組質粒。所述pCAMBIA1300:Super為在pCAMBIA1300的HindIII和XbaI酶切位點之間插入序列表的序列3所示的DNA得到的重組質粒。

擴增所述基因的全長或其任意片段的引物對也屬于本發明的保護范圍。

本發明還保護一種培育轉基因植物的方法,是將所述基因導入目的植物中,得到耐旱性高于所述目的植物的轉基因植物和/或失水率低于所述目的植物的轉基因植物。所述基因具體可通過所述重組表達載體導入所述目的植物中。攜帶有所述基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織,并將轉化的植物組織培育成植株。目的植物(被轉化的植物宿主)既可以是單子葉植物也可以是雙子葉植物。所述雙子葉植物可為擬南芥,如哥倫比亞生態型擬南芥。

所述基因可用于植物的育種。本發明提供了擬南芥中參與植物抗旱反應的蛋白和基因,對于進一步闡明植物抗旱的分子機理并通過基因工程的技術和手段培育優質、抗旱的作物新品種具有重要的理論意義和現實意義。

附圖說明

圖1為di19突變體中T-DNA的插入位置。

圖2為哥倫比亞生態型擬南芥和突變體di19中AtDi19基因的表達量比較。

圖3為哥倫比亞生態型擬南芥、突變體di19和過表達植株的Northern鑒定結果。

圖4為干旱條件下哥倫比亞生態型擬南芥、突變體di19和過表達植株的表型。

圖5為哥倫比亞生態型擬南芥、突變體di19和過表達植株干旱相關生理指標(失水率百分比)的比較。

圖6為干旱條件下哥倫比亞生態型擬南芥AtDi19基因的表達變化分析結果。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發明,但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料,如無特殊說明,均為自常規生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的%,如無特殊說明,均為質量百分含量。以下實施例中的定量試驗,均設置三次重復實驗,結果取平均值。

哥倫比亞生態型擬南芥(Col-0;Columbia):購自美國擬南芥生物資源中心(Arabidopsis?Biological?Resource?Center,ABRC)。

農桿菌GV3101:中國農業大學保證向公眾提供;參考文獻:Koncz,C.and?Schell,J.(1986)The?promoter?of?the?TL-DNA?gene?5?controls?the?tissue-specificexpression?of?chimaeric?genes?carried?by?a?novel?type?of?Agrobacterum?binaryvector.Mol.Gen.Genet.204,383-396.。

實施例1、AtDi19蛋白及其編碼基因的發現

一、突變體di19的獲得

從ABRC(Arabidopsis?Biological?Resource?Center)定購得到編號為SALK_088814的T-DNA插入突變體的T4代種子。T-DNA插入突變體的獲得是通過載體pBIN-pROK2將攜帶的T-DNA插入到哥倫比亞生態型擬南芥的目標基因,從而導致目標基因功能喪失。

利用網站(http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html)進行引物設計。對插入突變體進行T-DNA插入的純合鑒定。T-DNA插入突變體的鑒定利用3條引物,分別是LP、RP和Lba1;LP、RP為AtDi19基因組上的序列,Lba1為T-DNA插入左邊界的序列。三條引物的序列如下:

LP:5’-TCCAAAAGTTCGACAATTTCG-3’;

RP:5’-ACGCAACAGAACCATTACGAG-3’。

Lba1:5’-GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3’。

分別以LP/RP和Lba1/RP為引物對,以T-DNA插入突變體基因組DNA為模板進行PCR擴增,鑒定得到純合的T-DNA插入突變體di19(對干旱脅迫敏感的擬南芥突變體)。T-DNA插入在AtDi19基因編碼區域第二個外顯子(見圖1)。

二、AtDi19蛋白及其編碼基因的發現

TRizol(Invitrogen)法分別提取哥倫比亞生態型擬南芥和突變體di19幼苗的總RNA(100-200mg),經甲醛變性RNA瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性。單鏈cDNA的合成按照SUPERSCRIPTII的使用說明合成。將合成的單鏈cDNA稀釋10倍,作為模板進行PCR反應。

引物序列如下:

Primer1:5’-TCTAGAATGGACGCTGATTCCAAGAG-3’;

Primer2:5’-GAGCTCTTAGACTTCATCGAAAATGGCTG-3’。

PCR體系(20μL):2μL?10×PCR?Buffer,0.4μL?2.5mM?dNTP?mix,0.4μL?Primer1(10μM)、0.4μL?Primer2(10μM),0.1μL?Taq?enzyme(15U/μL)。

PCR程序(PE9700):95℃預變性5min;95℃30s,56℃30s,72℃1min,共計35個循環;72℃延伸10min。

PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果如圖2所示(條帶為621bp)。在野生型材料中能檢測到AtDi19基因的表達,在突變體di19中,不能檢測到AtDi19基因的表達,說明AtDi19基因完全被敲除。

回收621bp的PCR產物,連接到pMD18-T載體,酶切、擴增、測序鑒定。測序結果表明,PCR產物的核苷酸序列如序列表的序列2所示,編碼序列表的序列1所示的蛋白質。將序列1所示蛋白命名為AtDi?19蛋白,將AtDi?19蛋白的編碼基因命名為AtDi19基因。

實施例2、過表達擬南芥的獲得和耐旱性鑒定

一、AtDi19基因的克隆

1、提取生長10天的哥倫比亞生態型擬南芥幼苗的總RNA,用Takara公司的DNA酶消化RNA中的DNA,用消化后產物進行反轉錄得到cDNA。

2、以cDNA為模板用特異性引物對(F1和F2)進行PCR擴增,得到PCR擴增產物(AtDi19基因)。

F1:5’-tctagaTCTAGAATGGACGCTGATTCCAAGAG-3’(XbaI);

F2:5’-ggtaccGAGCTCTTAGACTTCATCGAAAATGGCTG-3’(KpnI)。

PCR擴增體系(50μL):5.0μL?10×Pyrobest?PCR緩沖液,1.0μL?10mM?dNTP?mix,F1和F2(10μM)各1.0μL,0.5μL?Pyrobest酶(Takara公司),3.0μL模板(0.1μg),補充滅菌超純水至50μL。

PCR擴增程序(在PE?9700儀器上進行):預變性5min;95℃變性30s,56℃30s,72℃?1min,循環數30個;72℃延伸5min。

二、重組表達載體的構建

(一)pCAMBIA1300:Super質粒的構建

1、以質粒pMSP-1(GENBANK?ACCESSION?NO.EU181145)為模板,用引物A和引物B進行PCR擴增,得到的PCR產物即為序列表的序列3所示的Super啟動子。

引物A:5’-aagcttGTGGGCCTGTGGTCTCAAGAT-3’;

引物B:5’-tctagaCTAGAGTCGATTTGGT-3’。

2、用限制性內切酶HindIII和XbaI雙酶切PCR產物,回收酶切產物。

3、用限制性內切酶HindIII和XbaI雙酶切質粒pCAMBIA1300(pCAMBIA1300-AT)(GENBANK?ACCESSION?NO.FJ362601),回收載體骨架。

4、將步驟2的酶切產物和步驟3的載體骨架連接,得到連接產物。

5、將連接產物進行測序,測序結果表明得到了pCAMBIA1300:Super質粒(在pCAMBIA1300的HindIII和XbaI酶切位點之間插入了序列表的序列3所示的DNA)。

(二)重組表達載體的構建

1、用限制性內切酶XbaI和KpnI雙酶切步驟一的PCR擴增產物,回收酶切產物。

2、用限制性內切酶XbaI和KpnI雙酶切質粒pCAMBIA1300:Super,回收載體骨架。

3、將步驟1回收的酶切產物和步驟2回收的載體骨架連接,得到連接產物。

4、將步驟3的連接產物進行測序,結果表明得到了重組質粒Super:AtDi19(骨架載體為pCAMBIA1300:Super,在XbaI和KpnI酶切位點之間插入了序列表的序列2所示的DNA)。

三、過表達植株的獲得

1、用Super:AtDi19轉化農桿菌GV3101,得到重組農桿菌。

2、重組農桿菌采用花浸泡法轉化侵染哥倫比亞生態型擬南芥,收獲T1代種子。T2代表示T1代自交產生的種子及由它所長成的植株,T3代表示T2代自交產生的種子及由它所長成的植株。在含50μg/L潮霉素的MS培養基上篩選T1代植株并進行T2代和T3代的分離比統計,在T3代得到轉Super:AtDi19擬南芥單拷貝純合株系(AtDi19過量表達株系Super:AtDi19-1和Super:AtDi19-2)。

四、對照植株的獲得

用pCAMBIA1300:Super代替Super:AtDi19,采用步驟三相同的方法,在T3代得到轉pCAMBIA1300:Super擬南芥單拷貝純合株系(對照植株)。

五、過表達植株和對照植株的鑒定

1、Northern?blot

分別檢測Super:AtDi19-1、Super:AtDi19-2、哥倫比亞生態型擬南芥(野生型)、對照植株和突變體di19中AtDi19基因的表達量,方法如下:

①Trizol法提取RNA

取植物材料加入液氮充分研磨至細粉末,迅速加入1mL?Trizol,充分搖勻,室溫放置5-15min,以使核酸蛋白復合物分解;加入200μL氯仿用力震蕩15sec,室溫放2-3min,然后12,000rpm,4℃離心15min;吸取上清,轉移至新Eppendorf管中,加入500μL異丙醇,室溫放置10min;12,000rpm離心10min;棄上清,加入1mL?75%乙醇洗滌;4℃,7,500rpm離心5min;吸棄上清,室溫干燥10-15min;加入適量經DEPC處理的H2O,55-60℃溶解5min,使其充分溶解,然后離心機輕甩,冰上放置;取適量RNA樣品稀釋相應倍數,進行RNA定量測定,確定RNA純度,剩余RNA在-80℃保存。

②RNA進行1.2%瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳

1.2%瓊脂糖甲醛變性凝膠:1.2g瓊脂糖,10mL?10×MOPS緩沖液,75mL?DEPC-H2O,加熱融化后冷卻至50-60℃時加入15mL甲醛。

取15-30μg?RNA樣品,加入適量上樣緩沖液,65℃變性10-15min,混勻;冰上靜置5min;4℃,7,500rpm離心2min以沉淀雜質;以1×MOPS為電泳緩沖液進行電泳,上樣前50V預電泳10-30min,上樣后先70V電壓至樣品跑出膠孔,然后以50V電壓電泳約3h,溴酚蘭至膠邊緣時停止電泳;在紫外燈下掃膠,然后切去多余的邊緣膠條,用無菌雙蒸水淋洗凝膠;用250mL?10×SSC浸泡凝膠兩次以洗去甲醛,每次20min,浸泡完畢可直接轉膜。

③轉膜

在磁盤中加入10×SSC溶液250mL,架一塊玻璃板,在上方放一層寬于凝膠的濾紙,兩頭浸入液體中,將凝膠倒扣于濾紙上排盡氣泡;剪取與膠大小一致的尼龍膜,在10×SSC中潤濕,鋪于膠上,再依次加3張濾紙、數層吸水紙,其上壓一塊玻璃板及重物;以10×SSC為轉移液,利用毛細管轉移法轉膜1-2天。

④制備探針

將步驟一的PCR擴增產物進行純化,然后采用Amersham?Biosciences的RediprimeTMII?Random?Prime?Labelling?System試劑盒按說明書進行標記,得到探針。標記步驟:在PCR反應管中加入25ng純化的片段,加pH?8.0的TE緩沖液至45μL,95℃變性5min,迅速放于冰上冷卻;將變性后的cDNA加入到Amersham公司的探針標記反應管中,到同位素室加入40-50μCi32P-dCTP反復吹吸12次,37℃水浴反應2h以上。

⑤雜交

步驟③轉膜完畢后,在膜上標記加樣孔位置,用2×SSC漂洗尼龍膜,之后用濾紙吸干或晾干,將尼龍膜包在濾紙中于80℃烘1-2h使RNA與雜交膜緊密結合;將雜交膜放入雜交管中,帶有RNA的一面向里,加入7-15mL預熱到65℃的Church緩沖液,65℃預雜交4-5h;棄去管中Church,重新加入7-8mL?Church,加入變性的探針(將步驟④制備的探針在沸水中變性15min,冰上迅速冷卻5min),65℃雜交16h以上;雜交結束后,65℃下洗膜,每次15min,并不斷用monitor檢測信號;洗膜完畢后,用保鮮膜包好,放入暗盒,壓磷屏,1-2天后掃磷板。

Northern?blot鑒定結果見圖3。Super:AtDi19-1和Super:AtDi19-2中AtDi19基因的表達量是要明顯高于野生型;突變體di19中沒有AtDi19基因的表達。

2、耐旱性鑒定

Super:AtDi19-1、Super:AtDi19-2、哥倫比亞生態型擬南芥(野生型)、對照植株和突變體di19分別進行耐旱性鑒定(每個株系50株)

(1)表型鑒定

將在MS培養基上生長6天的擬南芥幼苗移入土壤中繼續生長3周,正常澆水;3周后停止澆水,干旱處理18天;干旱處理18天后恢復正常澆水(復水)。整個過程中觀察植株表型并拍照。

結果見圖4。對照植株和野生型植株表型一致。干旱處理18天,突變體di19表現明顯的萎蔫癥狀,野生型表現輕微萎蔫,而Super:AtDi19-1和Super:AtDi19-2生長良好?;謴蜐菜?,di19不能繼續生長全部死亡(存活率為0%),而野生型、Super:AtDi19-1和Super:AtDi19-2都能繼續生長(存活率均為100%),Super:AtDi19-1和Super:AtDi19-2的長勢優于野生型。結果表明AtDi19過表達植株具有較野生型強的耐受干旱的能力。

(2)生理指標檢測

將MS培養基上生長6天的幼苗移栽到土壤中,生長四周,正常澆水。生長四周后,將植物材料的地上部剪下,立即稱重(W0),然后立即放在濕度40%、溫度23-25℃條件下;每間隔一定時間(將稱重后作為起始時間,0.5小時、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時后)進行稱重(Wt),每個株系重復稱重4次,取所有植株4次稱重的平均值。失水率=(W0-Wt)÷W0×100%。

結果見圖5和表2。對照植株和野生型植株的失水率沒有顯著差異;野生型植株的失水率顯著低于突變體di19;Super:AtDi19-1和Super:AtDi19-2的失水率顯著低于野生型植株。

表2??各個植株的失水率

??失水率 ??Super:AtDi19-1 ??Super:AtDi19-2 ??野生型 ??di19 ??0.5小時 ??18.6576 ??19.3480 ??23.2562 ??23.8804 ??1小時 ??22.8726 ??24.1929 ??28.4079 ??29.8406 ??2小時 ??30.2339 ??31.6492 ??36.0048 ??38.8221 ??3小時 ??37.3814 ??38.2158 ??42.7318 ??46.2482 ??4小時 ??43.6769 ??44.1968 ??48.3684 ??52.5106 ??5小時 ??48.6499 ??48.9409 ??53.1068 ??58.5784 ??6小時 ??53.0882 ??53.4257 ??57.9933 ??64.0489

單位時間(每小時)的失水量表現為地上部的失水速率。突變體di19失水速率較野生型快,AtDi19過表達植株失水速率較野生型慢,對照植株失水速率和野生型一致。

實施例3、AtDi19基因的表達變化

將MS培養基上生長6天的哥倫比亞生態型擬南芥幼苗移栽到土壤中,生長四周,正常澆水。生長四周后,將植物材料的地上部剪下,立即放在濕度40%、溫度23-25℃條件下;每間隔一定時間取樣(剛剛剪下的取樣時間作為0小時,分別于0小時、1小時、3小時和5小時取樣)。

采用Invitrogen?Trizol?Reagent提取樣本總RNA;將總RNA用Takara公司的DNA酶消化RNA中的DNA,然后進行反轉錄得到cDNA;以cDNA為模板,按ABI?SYBR?Green的產品說明書進行Realtime?PCR(所用引物為F1和F2)。

F1:5’-tctagaTCTAGAATGGACGCTGATTCCAAGAG-3’(XbaI);

F2:5’-ggtaccGAGCTCTTAGACTTCATCGAAAATGGCTG-3’(KpnI)。

以0小時的表達量為1,其它取樣時間的表達量與0小時表達量的比值作為該時間的相對表達量作圖,見圖6。在干旱處理條件下,AtDi19基因表達明顯升高,在處理1h后,AtDi19基因的表達就開始明顯受誘導,說明AtDi19基因受干旱誘導表達。

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植物 耐旱 相關 蛋白 AtDi19 及其 編碼 基因 應用
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