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微陣列測定中的次級捕獲的抑制.pdf

摘要
申請專利號:

CN200980144848.9

申請日:

20091104

公開號:

CN102209792A

公開日:

20111005

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:

IPC分類號:

C12Q1/68

主分類號:

C12Q1/68

申請人:

霍夫曼-拉羅奇有限公司

發明人:

T·阿爾伯特,J·杰德洛,B·斯文松

地址:

瑞士巴塞爾

優先權:

61/111881

專利代理機構:

中國專利代理(香港)有限公司

代理人:

劉辛;郭文潔

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內容摘要

本發明提供了用于靶向的序列富集的組合物、方法和系統。特別地,本發明提供了:通過抑制非靶核酸序列的次級捕獲而在微陣列測定中的雜交過程中富集靶向的核酸序列。

權利要求書

1.一種抑制核酸雜交中的次級捕獲的方法,包括以下步驟:a)將一個或多個核酸探針固定以捕獲樣品中的靶核酸序列;b)向所述樣品中加入次級捕獲抑制劑,其中所述次級捕獲抑制劑包括物種特異性Ct-1?DNA和雜交阻斷寡核苷酸;和c)將所述樣品和所述次級捕獲抑制劑施加到所述探針中,以與所述靶序列雜交。2.根據權利要求1的方法,其中所述物種特異性Ct-1?DNA是人Ct-1?DNA并且所述靶核酸序列是人核酸。3.根據權利要求1的方法,其中所述物種特異性Ct-1?DNA是小鼠Ct-1DNA并且所述靶核酸序列是小鼠核酸。4.根據權利要求1的方法,其中所述物種特異性Ct-1?DNA是植物Ct-1DNA并且所述靶核酸序列是植物核酸。5.根據權利要求4的方法,其中所述植物Ct-1是玉米Ct-1并且所述靶核酸是玉米核酸。6.根據權利要求1-5的方法,其中所述次級捕獲抑制劑以相對于靶核酸序列至少5倍摩爾過量的量存在。7.根據權利要求1-6的方法,其中所述靶核酸序列包括DNA文庫并且其中所述文庫包括自我互補性接頭。8.根據權利要求1-6的方法,其中所述靶核酸序列包括DNA文庫并且其中所述文庫包括非互補性接頭。9.根據權利要求1-6的方法,其中所述靶核酸序列包括DNA文庫并且其中所述文庫包括基于Y的接頭。10.根據權利要求1-9的方法,其中所述雜交阻斷寡核苷酸具有與接頭連接的核酸互補的序列。11.一種抑制核酸雜交中的次級捕獲的方法,包括以下步驟:a)將一個或多個核酸探針固定以捕獲樣品中的靶核酸序列;b)向所述樣品中加入次級捕獲抑制劑,其中所述次級捕獲抑制劑包括雜交阻斷寡核苷酸,其與接頭連接的核酸互補;和c)將所述樣品和所述次級捕獲抑制劑施加到所述探針中,以與所述靶序列雜交。12.包含物種特異性Ct-1?DNA和雜交阻斷寡核苷酸的組合物,其中所述組合物用于阻斷基于雜交的測定中的次級捕獲。13.根據權利要求12的組合物,其中所述物種特異性Ct-1?DNA選自人Ct-1、小鼠Ct-1或植物Ct-1。14.根據權利要求12-13的組合物,其中所述雜交阻斷寡核苷酸具有與接頭連接的核酸互補的序列。15.根據權利要求13的組合物,其中所述植物Ct-1是玉米Ct-1。

說明書

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技術領域

本發明提供了用于靶向的序列富集的組合物、方法和系統。特別地,本發明提供了:通過抑制非靶核酸序列的次級捕獲而在微陣列測定中的雜交過程中富集靶向的核酸序列。

背景技術

核酸微陣列技術的出現使得在非常小的區域例如在顯微鏡載玻片上建立數以百萬計的核酸序列的陣列成為可能(例如美國專利號6,375,903和5,143,854)。最初,此類陣列是通過將預先合成的DNA序列點染至載玻片上而制備的。但是,如美國專利號6,375,903中描述的無掩膜的陣列合成器(MAS)的構建現在允許直接在載玻片本身上原位合成寡核苷酸序列。

使用MAS儀器,在微陣列中待構建的寡核苷酸序列的選擇由軟件控制,從而現在有可能基于研究人員的特定需求單獨地產生個性化陣列。一般而言,基于MAS的寡核苷酸微陣列合成技術允許在標準的顯微鏡載玻片的非常小的區域內平行合成數以百萬計的獨特寡核苷酸特征。隨著數以百種生物的完整基因組的可獲得(它們的參考序列一般已經保存于公共數據庫),微陣列已被用于在分離自多種生物的核酸中執行序列分析。

核酸微陣列技術已經應用于很多研究和診斷領域,例如基因表達和發現、突變檢測、等位基因和進化序列比較、基因組作圖、藥物開發等等。很多應用需要在整個人類基因組范圍內搜索那些解釋人類疾病的遺傳變體和突變。在復雜疾病的情況下,這些搜索一般會產生與疾病和/或疾病風險相關的單核苷酸多態性(SNP)或SNP的組。已證明鑒定此類SNP是艱難的任務并且經常是沒有成果的,這是因為需要對來自受影響的個體或組織樣品的基因組DNA的大的區域(通常大于100,000堿基(100Kb))進行重新測序,以找尋單一的堿基變化或鑒定所有的序列變體。其它的應用包括鑒定也可能與癌癥相關的染色體序列的獲得和丟失,所述癌癥為例如淋巴瘤(Martinez-Climent?JA等人,2003,Blood?101:3109-3117)、胃癌(Weiss?MM等人,2004,Cell.Oncol.26:307-317)、乳腺癌(Callagy?G等人,2005,J.Path.205:388-396)和前列腺癌(Paris,PL等人,2004,Hum.Mol.Gen.13:1303-1313)。因此,微陣列技術對于科學研究人員和臨床人員理解疾病和治療疾病的治療方案的功效是極其有用的工具。

通常而言,基因組太復雜以致于不能作為一個整體來研究,必須使用一些技術來降低基因組的復雜性。為了解決這個問題,一個方案是減少來自DNA樣品的某些類型的高豐度序列,如美國專利6,013,440所記載。替代性方式則使用用于富集基因組序列的方法和組合物,例如在Albert等人(2007,Nat.Meth.,4:903-5),Okou等人(2007,Nat.Meth.4:907-9),Olson?M.(2007,Nat.Meth.4:891-892),Hodges等人(2007,Nat.Genet.39:1522-1527)中所描述,以及如美國專利申請系列號11/638,004、11/970,949和61/032,594所記載。Albert等人公開了一種既成本劃算又迅速有效降低基因組樣品的復雜性的替代性方式,其通過使用者確定的方式以允許進行進一步處理和分析。Lovett等人(1991,Proc.Natl.Acad.Sci.88:9628-9632)也描述了使用細菌人工染色體進行基因組選擇的方法。通過進行靶序列富集然后測序以降低基因組的復雜性遠遠優越于單獨測定雜交事件。雜交事件允許任意種類在微陣列中雜交;包括靶序列和非靶序列等。通過進行復雜性降低和序列富集,研究人員增加了所捕獲的在靶序列(on-target?sequence)(例如是測定焦點的那些序列),同時減少了所捕獲的非靶序列的數量(例如那些不是測定焦點的序列)。

但是,任何微陣列測定中都存在的一個問題是:重復性核酸序列的交叉捕獲的事件,也稱作在靶核酸雜交過程中,陣列上的非靶核酸序列的次級捕獲。次級捕獲通過非靶標捕獲而潛在地淹沒想要的靶標捕獲,導致靶標捕獲的效率降低,降低了復雜性減低和其它微陣列測定的效率。

因此,需要抑制在微陣列測定中發生次級捕獲反應的方法,從而為研究工作增加靶核酸捕獲的效率。

發明內容

微陣列形式中的次級捕獲反應導致靶核酸捕獲效率的降低。這種降低的效率見于由微陣列測定得到的在靶讀數(on-target?read)的百分率,從而,當次級捕獲不被抑制時,捕獲的非靶核酸的量增加并且靶核酸的量減少。本發明總結為用于抑制微陣列中的次級捕獲的方法、系統和組合物。以下描述了本發明的一些解釋性的實施方式。本發明不限于這些實施方式。

本發明的實施方式包括固定的核酸探針,其用于通過使樣品與固體支持物或溶液中的探針或探針衍生的擴增子雜交而捕獲來自例如基因組樣品的靶核酸序列。如本文描述的雜交反應包括將物種特異性的阻斷DNA加入到微陣列測定中的反應中。物種特異性的阻斷DNA包括例如,在人特異性微陣列雜交中,摻合人C0t-1?DNA與人靶核酸;在小鼠特異性微陣列雜交中,摻合小鼠C0t-1DNA與小鼠靶核酸;以及在玉米特異性微陣列雜交中,摻合玉米C0t-1?DNA與玉米靶核酸。

本發明的其它實施方式包括固定的核酸探針,其用于通過使樣品與固體支持物或溶液中的探針或探針衍生的擴增子雜交而捕獲來自例如基因組樣品的靶核酸,其中所述靶核酸與位于片段化的核酸樣品的5’和3’末端之一或二者的接頭連接子附著,所述接頭連接子用于連接介導的聚合酶鏈式反應(LM-PCR)方法并用于測序應用。如本文描述的雜交反應包括將如上所述的物種特異性的阻斷DNA加入到微陣列中的雜交反應中,和/或將合成的雜交阻斷寡核苷酸摻入到微陣列中的雜交反應中。上文已經描述了物種特異性的阻斷DNA。將雜交阻斷寡核苷酸摻入到微陣列雜交中以阻斷由于例如接頭介導的次級捕獲而引起的次級捕獲。

在復雜性減低測定中摻入如本發明提供的物種特異性的阻斷DNA和/或雜交阻斷寡核苷酸會抑制次級捕獲,從而與在雜交中使用非物種特異性阻斷DNA相比,增加雜交過程中所捕獲的在靶核酸序列(例如想要的靶序列)的量。優選洗滌所捕獲的靶核酸并將探針洗脫掉。在一些實施方式中,本發明提供了在基于溶液的形式中的靶向的序列的富集和非靶向的序列的次級捕獲的抑制??紤]到本發明不限于微陣列底物。微陣列底物包括但不限于,載玻片、芯片、珠子、基于溶液的、管、柱、孔、板,等等。

基因組樣品在本文中用作描述性目的,但是應該理解,其它非基因組樣品可以經歷同樣的程序,因為本發明提供了與任意核酸靶標(不論其來源)相關聯的非靶標次級捕獲的抑制。本發明提供的靶標富集的效率的增加為研究人員提供了用于與疾病和疾病狀態相關的研究和治療的卓越工具,所述疾病為例如,略舉幾例,癌癥(Durkin等人,2008,Proc.Natl.Acad.Sci.105:246-251;Natrajan等人,2007,Genes,Chr.And?Cancer?46:607-615;Kim等人,2006,Cell125:1269-1281;Stallings等人,2006Can.Res.66:3673-3680)、遺傳病癥(Balciuniene等人,Am.J.Hum.Genet.出版中)、精神疾病(Walsh等人,2008,Science?320:539-543;Roohi等人,2008,J.Med.Genet.Epub?18?March?2008;Sharp等人,2008,Nat.Genet.40:322-328;Kumar等人,2008,Hum.Mol.Genet.17:628-638),以及進化和基礎性研究(Lee等人,2008,Hum.Mol.Gen.17:1127-1136;Jones等人,2007,BMC?Genomics?8:402;Egan等人,2007,Nat.Genet.39:1384-1389;Levy等人,2007,PLoS?Biol.5:e254;Ballif等人,2007,Nat.Genet.39:1071-1073;Scherer等人,2007,Nat.Genet.S7-S15;Feuk等人,2006,Nat.Rev.Genet.7:85-97)。

本發明提供了分離和降低多個核酸分子的遺傳復雜性的方法,所述方法包括以下步驟:將所述種群的片段化的、變性的核酸分子在雜交條件下暴露于相同的或多個不同的結合于固體支持物上的寡核苷酸探針,以捕獲與所述探針特異性雜交的核酸分子,或者,將所述種群的片段化的、變性的核酸分子在雜交條件下暴露于相同的或多個不同的寡核苷酸探針,然后使雜交的分子的復合物與固體支持物結合,以捕獲與所述探針特異性雜交的核酸分子,其中在兩種情況下,所述片段化的、變性的核酸分子具有大約100至大約1000個核苷酸殘基的平均大小,優選大約250至大約800個核苷酸殘基,最優選大約400至大約600個核苷酸殘基;使未結合的和非特異性雜交的核酸與捕獲的分子分離;洗脫捕獲的分子;和任選以洗脫的捕獲的分子將上述方法重復至少一個循環和/或對富集的靶核酸進行測序。

在一些實施方式中,所述靶核酸分子選自動物、植物或微生物。如果僅可獲得有限的核酸樣品,則可以在實施本發明的方法之前擴增核酸,例如通過全基因組擴增。預先擴增可能對于執行本發明的方法是必要的,例如,用于法醫的目的(例如,用于遺傳鑒定目的的法醫醫藥)。

在一些實施方式中,靶核酸分子的群體是基因組DNA分子的群體。在此類實施方式中,探針選自例如確定來自多個遺傳基因座的一個或多個外顯子、內含子或調節序列的一個或多個序列,或確定至少一個單一遺傳基因座的完整序列的多個探針,所述基因座的大小為至少100kb,優選至少1Mb,或至少一個如上文指定的大小,一個或多個確定單核苷酸多態性(SNP)的探針,或多個確定陣列的探針,所述陣列為例如設計以用于捕獲至少一個完整染色體的完整序列的tiling陣列。

在一些實施方式中,本發明包括以下步驟:在將片段化核酸樣品暴露于探針以進行雜交之前或之后,將接頭分子連接至核酸分子的一個或兩個末端,優選兩個末端。在一些實施方式中,本發明的方法還包括使用至少一個引物擴增靶核酸分子,所述引物包含與所述接頭分子的序列特異性雜交的序列。在一些實施方式中,所述接頭分子是自我互補的、非互補的或是Y-接頭(例如這樣的寡核苷酸:一旦退火,則包含互補性末端和非互補性末端,其互補性末端與片段化的核酸樣品退火)。在一些實施方式中,可以將擴增的靶核酸序列測序,與重測序或SNP-calling陣列雜交,并且可以進一步分析序列或基因型。

在一些實施方式中,本發明提供了用于基因組樣品中的靶核酸序列(例如外顯子或變體,優選SNP位點)的復雜性減低的方法。這可以這樣實現:合成一個或多個對基因組的區域有特異性的基因組探針,以捕獲復雜基因組樣品中包含的互補性靶核酸序列。富集方法包括:加入物種特異性阻斷DNA和雜交阻斷寡核苷酸中的一個或二者。

在一些實施方式中,本發明還包括測定富集的和洗脫的靶分子的核酸序列,尤其是通過進行測序反應來進行。

在一些實施方式中,本發明涉及試劑盒,其包含用于執行根據本發明的方法的組合物和試劑。此類試劑盒可以包含下列物質,但不限于:雙鏈接頭分子、固體支持物,其包含用于任何特定微陣列應用(例如比較型基因組雜交、表達、染色質免疫沉淀、比較型基因組測序,等等)的多個雜交探針,以及物種特異性阻斷DNA和雜交阻斷寡核苷酸中的一個或多個。在一些實施方式中,試劑盒包含兩種不同的雙鏈接頭分子。試劑盒還可以包含至少一個或多個選自下列的其它成分:DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶、T4DNA連接酶、雜交溶液、洗滌溶液,和/或洗脫溶液。

附圖說明

圖1例示了兩種不同類型的次級捕獲。

圖2例示了以人類靶DNA進行的微陣列中,不同類型的阻斷DNA的效應?!叭恕贝砣说腃0t-1,“鮭魚”代表鮭魚精DNA,“小鼠”代表小鼠C0t-1,“無”代表沒有阻斷DNA(陰性對照)。

圖3例示了在微陣列捕獲實驗中使用物種特異性阻斷DNA的重要性。

圖4顯示了一種進行靶向的樣品核酸的序列捕獲的方法的示例性流程。在該示例性流程中,將DNA樣品片段化,將接頭(例如連接子)添加到片段化DNA的末端,例如使用用于產生DNA文庫的試劑盒。使用附著至片段化DNA的末端的連接子擴增單鏈模板,例如通過連接介導的聚合酶鏈式反應方法(LM-PCR)。將樣品變性,與微陣列底物雜交,洗滌并洗脫。使用接頭序列擴增洗脫的樣品,隨后測序。

圖5例示了在微陣列捕獲測定中使用雜交阻斷寡核苷酸以阻斷接頭介導的次級雜交(當接頭與靶核酸連接時)的重要性。

定義

如本文使用的術語“樣品”以其最廣泛的含義使用。在一個含義中,其意指包括獲自任何來源的樣本或培養物,優選生物來源,可以是真核的或原核的。生物樣品可以獲自動物(包括人)并且包括液體、固體和組織。生物樣品包括血液制品,例如血漿、血清等。來自非人動物的樣品包括但不限于,來自脊椎動物例如嚙齒類、非人靈長類、綿羊、牛、反芻動物、兔、豬、山羊、馬、犬、貓、鳥等脊椎動物的生物樣品。此外,如本文使用的樣品包括來自植物的生物樣品,例如源自植物界中存在的任何生物(例如單子葉植物、雙子葉植物等)的樣品。樣品還可以來自真菌、藻類、細菌等。預期本發明不限于樣品的來源。如本文使用的樣品通常是包含來自任意來源的核酸(例如DNA、RNA、cDNA、mRNA、tRNA、miRNA等)的“核酸的樣品”或“核酸樣品”,或“靶核酸樣品”,或“靶樣品”。因此,本發明的方法和系統中使用的核酸樣品是源自任意生物(真核或原核)的核酸樣品。

如本文使用的術語“靶核酸分子”和“靶核酸序列”相互替代地使用,是指來自待研究的靶基因組區域的分子或序列。預先選定的探針決定靶向的核酸分子的范圍。因子,所尋求的是,將“靶標”從其它核酸序列中分選出來?!皡^段”定義為靶序列內的核酸區域,即核酸序列的“片段”或“部分”。因此,“在靶讀數”是被測序的并且被發現是研究人員想要的序列的那些靶核酸的百分率或數目。

當用于與核酸相關時,例如用在“分離核酸”中時,如本文使用的術語“分離體”是指從在其天然來源中通常與其結合的至少一種成分或污染物中鑒定并分離出來的核酸序列。分離的核酸的形式或狀態不同于其天然存在的形式或狀態。相反,非分離的核酸是以其天然狀態存在的核酸例如DNA和RNA。分離的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以以單鏈或雙鏈形式存在。

如本文使用的術語“寡核苷酸”是指長度短的單鏈多核苷酸的鏈。寡核苷酸的長度通常在200個殘基以下(例如15至100個),但是,如本文所使用,該術語還意在包括較長的多核苷酸鏈。寡核苷酸通常通過其長度進行指稱。例如,24個殘基的寡核苷酸被稱作“24-聚體”。寡核苷酸可以通過自身雜交或通過與其它多核苷酸雜交而形成二級或三級結構。此類結構可以包括但不限于,雙螺旋、發夾、十字形、彎曲和三螺旋。

如本文使用的術語“雜交”用于指互補性核酸的配對。雜交和雜交強度(例如核酸之間的結合強度)受到以下因素的影響,例如核酸之間的互補性程度、涉及的條件的嚴格性、形成的雜交體的解鏈溫度(Tm),以及核酸的G∶C比。雖然本發明不被特定組的雜交條件所限制,但優選使用嚴格雜交條件。嚴格雜交條件是序列依賴性的,并且隨著不同環境參數(例如鹽濃度、有機物質的存在等)而有所不同。一般而言,將“嚴格”條件選擇為,比特定核酸序列在確定的離子強度和pH時的Tm低大約50℃至約20℃。優選地,嚴格條件為,比特定核酸與互補性核酸結合的熱熔解點低大約5℃至10℃。Tm是(在確定的離子強度和pH時)指50%的核酸(例如靶核酸)與完美匹配的探針雜交時的溫度。

“嚴格條件”或“高度嚴格條件”可以是例如在50%的甲酰胺,5x?SSC(0.75MNaCl,0.075M檸檬酸鈉),50mM磷酸鈉(pH?6.8),0.1%焦磷酸鈉,5x?Denhardt溶液,經超聲處理的鮭魚精DNA(50mg/ml),0.1%SDS,和10%葡聚糖硫酸酯中,在42℃雜交;在42℃在0.2%SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)和50%甲酰胺中在55℃洗滌,然后以含有EDTA的0.1x?SSC在55℃洗滌。舉例而言,但非限制,預期含有35%甲酰胺,5x?SSC和0.1%(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)的緩沖液適合于在中等非嚴格條件下在45℃雜交16-72小時。

此外,預想到可以在20%-45%的范圍內適宜地調整甲酰胺的濃度,這取決于探針長度和所需的嚴格性水平。在多個來源中提供了雜交條件的另外的實例,包括Molecular?Cloning:A?Laboratory?Manual,Sambrook等人編,Cold?Spring?Harbour?Press(通過引用方式全文并入本文)。

類似地,“嚴格”洗滌條件通常是通過經驗確定的,用于靶標與探針的雜交,或者在本發明中,用于靶標與探針衍生的擴增子的雜交。擴增子/靶標發生雜交(例如在嚴格雜交條件下),然后以含有連續降低的濃度的鹽或連續升高的濃度的去污劑的緩沖液洗滌或在漸增的溫度洗滌,直至特異性與非特異性雜交的信噪比高到足以促進特異性雜交的檢測。嚴格溫度條件通常包括大約30℃以上,更通常是大約37℃以上,偶爾大約45C以上的溫度。嚴格的鹽條件通常是大約1000mM以下,通常大約500mM以下,更通常是大約150mM以下(Wetmur等人,1966,J.Mol.Biol.,31:349-370;Wetmur,1991,Critical?Reviews?in?Biochemistry?and?Molecular?Biology,26:227-259,通過引用方式全文并入本文)。

如本文使用的術語“引物”是指寡核苷酸,可以是天然存在的作為純化的限制性消化物,或通過合成產生的,當被置于“互補于核酸鏈的引物延伸產物的合成被誘導”的條件(例如存在核苷酸和例如DNA聚合酶的誘導劑以及在合適的溫度和pH)下時,其能夠作為合成的起始點。引物優選為單鏈的,以使擴增效率最大化。優選地,引物是寡脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠長以便在存在誘導劑的情況下引發延伸產物的合成。引物的確切長度將取決于很多因素,包括溫度、引物來源和使用的方法。

如本文使用的術語“探針”是指寡核苷酸(例如核苷酸序列),可以是天然存在的作為純化的限制性消化物,或通過合成產生的,重組的,或通過PCR擴增產生的,其能夠與另一個感興趣的寡核苷酸例如靶核酸序列的至少一部分雜交。探針可以是單鏈的或雙鏈的。探針用于檢測、鑒定和分離特定的基因序列。如本文使用的探針通常附著于微陣列底物,使用MAS通過原位合成,或者通過技術人員已知的任何其它方法合成,并與靶核酸雜交。

如本文使用的術語“接頭(adapter)”(或“連接物”(adaptor))是確定的(或已知的)序列的雙鏈寡核苷酸,其附著于樣品DNA分子的一個或兩個末端??梢栽诩尤胨鼈冎皩悠稤NA分子進行片段化或不片段化。在接頭被添加到樣品DNA分子的兩個末端的情形中,接頭可以是相同的(即在兩個末端具有同源序列)或不同的(即在各末端具有異源序列)。為了連接介導的聚合酶鏈式反應(LM-PCR)的目的,術語“接頭”和“連接子”相互替代地使用。接頭的兩條鏈可以自我互補、非互補或部分互補(例如Y-形狀)。接頭通常是12個核苷酸殘基至100個核苷酸殘基,優選18個核苷酸殘基至100個核苷酸殘基,最優選20至44個核苷酸殘基。

當提供數值的范圍時,應該理解為,除非上下文另有明確指明,否則也具體公開了該范圍的上限和下限之間的每個中間數值,達到下限的單位的十分位。本發明包括指定范圍內任意指定數值或中間數值之間的每個較小范圍,或者該指定范圍中的任意其它指定的或中間的數值。這些較小范圍的上限和下限可以獨立地包括在該范圍內或排除在該范圍外,并且每個范圍(其中兩個端點值之一包括在、均不包括在,或二者均包括在該較小范圍內)也包括在本發明內,服從該指定范圍內任意具體排除的端點值。當指定范圍包括一個或兩個端點值時,排除所包括的端點值之一或二者的范圍也包括在本發明內。

具體實施方式

微陣列測定中的次級捕獲包括未在微陣列探針捕獲設計中表示的序列(例如Alu、THE-1、LINE-1重復序列等)的基于雜交的相互作用(圖1)。一種類型的次級捕獲,例如,見于非雜交的樣品DNA與與探針雜交的靶DNA之間(“序列介導的次級捕獲”)。另一種類型的次級捕獲是附著于靶DNA的接頭或連接子序列之間的雜交(“接頭介導的次級捕獲”)。例如,當在微陣列測定中接頭與其互補序列雜交時,發生接頭介導的次級捕獲。例如,在次級捕獲中,探針與其靶標特異性雜交,但是該靶標具有一些也與非順式拷貝雜交的非探針序列(例如Alu、THE-1、LINE-1重復序列等)。次級捕獲的一個結果是靶樣品內重復性元件(例如非靶序列)的特定子集的富集,導致靶區域的總體富集較差。本質上講,不需要的類型的局部重復序列的共同富集導致微陣列上需要通過捕獲而被富集的靶序列被淹沒。

如本文所描述,本發明的方法、系統和組合物提供了對于微陣列測定中的次級捕獲的抑制,從而增加了靶序列的捕獲。以下描述了本發明的一些示例性實施方式。本發明不限于這些實施方式。

進行競爭性或抑制性的雜交以阻斷次級捕獲包括阻斷使用復雜的DNA時可能獲得的潛在的強烈的重復性DNA信號的捕獲。例如,將DNA變性,并允許在存在處于溶液中的總基因組DNA或優選就高重復性DNA序列進行富集的部份重新退火。在任一情況下,靶DNA中的高度重復性DNA相對于探針中的重復性元件以大量過量而存在(因為總是以盡可能少的重復序列來產生陣列)。因此,此類序列將會容易地與靶標內的重復性序列的互補性鏈結合,加入大量過量的相同類型的重復序列的外源拷貝,從而有效阻斷它們與靶序列的雜交。因此,在雜交反應中使用阻斷劑。

更有效的是使用就高度重復性DNA序列(例如Alu、THE-1和LINE-1重復序列)進行富集的總基因組DNA的部份,而不是使用總基因組DNA作為雜交中的阻斷劑。對于復雜的人類DNA和其它復雜的基因組而言,后者通常包括制備被稱作C0t-1?DNA的DNA部份(例如,復性時間的DNA濃度依賴系數為1.0)。C0t-1?DNA可以從商業上獲得,或者可以使用已經建立的技術來制備(見Human?Molecular?Genetics?2,Strachan和Read編輯,John?Wiley&Sons,Inc.)。按照本文的描述制備了玉米C0t-1?DNA。

在實驗過程中觀察到:在靶標富集實驗中采用C0t-1?DNA改善了在靶測序結果。但是,令人驚奇地觀察到,使C0t-1?DNA與靶物種匹配提供了最佳的捕獲性能。此外還確定了,當使用接頭連接的靶核酸并且將互補于那些靶序列的寡核苷酸序列另外加入到微陣列中的雜交反應中時,觀察到關于在靶捕獲的進一步改善。本發明不限于特定的機理。事實上,理解機理不足以實施本發明。然而,預期該效應不是通過抑制微陣列的非特異性結合能力而介導的,而是通過C0t-1?DNA中的過量的特異性序列猝滅重復介導的樣品DNA中的次級捕獲。

經典的基于雜交的序列表征使用阻斷劑以阻止標記的探針與尼龍或硝酸纖維素固體支持物相互作用。在那些研究中,經評估用于抑制這種非特異性DNA結合活性的試劑多數通常是鮭魚精DNA(鮭魚基因組主要包含重復序列,尤其比小鼠或人類基因組的重復序列多),或純化的酵母tRNA的混合物。從Southern類型的分析到基于微陣列的研究的轉變帶來了非特異性阻斷的使用。目前,關于在陣列雜交中是否必需使用C0t-1存在爭議,因為一些應用和生產商(例如Agilent?Technologies,Abbott?Laboratories等)推薦C0t-1用于比較型基因組雜交,而其它的(例如Roche?NimbleGen,Inc.)則不推薦。

目前認為:阻斷非特異性捕獲所需的僅是任意C0t-1?DNA,與阻斷劑的來源無關,此類阻斷都產生相同的捕獲性能。事實上,目前人C0t-1?DNA被推薦用于人和小鼠靶序列捕獲方法,并且設想使用鮭魚精DNA來抑制微陣列雜交測定過程中可能發生的非特異性雜交將產生與任何C0t-1?DNA等同的作用。這是所希望知道的,因為C0t-1?DNA成本是將近鮭魚精DNA的30倍。然而,業已觀察到來自不同物種的C0t-1?DNA對例如復雜性減低測定(其中人類DNA序列是被捕獲和富集的靶序列(圖2))有害。在開發本發明的實施方式時,使用相同的DNA文庫集(人的或小鼠的)和相同的陣列設計,一式三份地進行了復雜性減低測定。所有3個捕獲使用相同數量的DNA文庫(1ug)和100ug阻斷劑DNA:人C0t-1、小鼠C0t-1或鮭魚精DNA。進行了對照捕獲以輔助鑒定成功差異。從圖2可以看出,以人C0t-1?DNA進行的人文庫DNA捕獲是成功的(產生大約85%的在靶讀數),而使用小鼠C0t-1進行的人的測定表現較差(被認為是失敗),使用鮭魚精DNA阻斷的人測定與不存在阻斷DNA時的測定(陰性對照,被認為是失敗)相同。但是,應該注意,較高濃度的鮭魚精DNA(即200微克/捕獲雜交)產生了改善的結果。當使用小鼠靶標序列時,見到了相似的式樣,從而當使用小鼠C0t-1代替人C0t-1或鮭魚精DNA時實現了最佳靶標捕獲。

為了研究當使用非哺乳動物靶核酸時是否存在此現象,進行了微陣列實驗,其中使用經濟上具有重要意義的植物農作物物種(在本例中為玉米)的DNA進行靶序列富集。對于玉米靶標捕獲,研究了多種潛在的次級捕獲阻斷劑:鮭魚精DNA、不含接頭的過量的玉米基因組DNA、PCR擴增的玉米重復區域的集合,以及綠豆核酸酶產生的玉米C0t-1?DNA。在玉米靶標富集中使用人C0t-1DNA產生了大約1%(0.94%)的在靶讀數;從現實角度而言即失敗了。

如表1所示的定量PCR(qPCR)數據證明:當使用玉米C0t-1?DNA作為針對次級捕獲的阻斷DNA時,非靶序列的排除是最佳的,并且靶序列的富集是最佳的。

表1

在富集微陣列測定中使用兩個近親繁殖的玉米栽培變種B73和Mo17。B73富集實驗中摻入了鮭魚精DNA(B73捕獲1,無阻斷),其顯示沒有Mez和Fie靶序列的富集。使用玉米C0t-1?DNA作為阻斷劑(B73捕獲2,cot1)顯示最大程度上消除了不想要的靶標(如通過GAPC和肌動蛋白的qPCR所追蹤顯示)和B73靶序列的最大富集(排名第1)。使用8個PCR擴增的玉米重復性序列也有效阻斷了非靶B73序列的富集(B73捕獲3,PCR阻斷(Lamb等人,Chromosome?Res.2007;15:33-49)),雖然效果不如玉米C0t-1?DNA好。使用玉米C0t-1阻斷非靶序列的次級捕獲使捕獲的靶序列的在靶百分率增加大約30%-36%,這取決于如何進行分析。此外,當使用玉米的總基因組DNA作為阻斷劑時(B73捕獲4,cold?B73),靶序列富集較差,因此說明靶序列分子可能被競爭而脫離陣列。因此,本發明的一個實施方式提供了主要由重復序列組成的物種特異性阻斷劑。

當聯合起來考慮時,這些數據說明:在復雜性減低測定中,在靶富集是抑制重復序列-重復序列介導的分子間相互作用的結果。雖然尚不清楚這些相互作用是否發生于固體支持物中或溶液中,但清楚的是,由于證明鮭魚精不阻斷次級捕獲,所以預期C0t-1的作用不是抑制陣列的非特異性DNA結合能力。然而,本發明不受到物種特異性C0t-1?DNA阻斷次級捕獲的作用模式或發生位置的限制。

在開發本發明的實施方式時,還研究了附著于片段化的靶序列的較長的LM-PCR連接子或接頭(44bp的連接子,而非22-24bp的連接子)對于微陣列測定中靶序列的富集的效應。在片段化的靶DNA的末端引入LM-PCR接頭允許例如在富集前擴增基因組DNA,從擴增的群體中發生靶序列的富集。用于接頭附著的一個示例性方法是制備測序文庫,例如,通過使用文庫方法來進行,其中可以使用GS?FLX測序儀在來自454?Life?Sciences(Branford,CT)的序列分析方法中對經富集的靶標直接測序。但是,本發明不受用于產生文庫和進行測序的方法的限制,并且本實施例僅顯示了本發明的一種可能的實施方式(例如,技術人員將認識到替代性方法同樣可適用于本發明)。圖4中顯示了LM-PCR連接的靶序列的示例性流程。在一些實施方式中,添加到復雜性減低測定中的次級捕獲阻斷劑DNA不僅包括物種特異性C0t-1?DNA,而且包括短的(24bp)接頭互補性寡核苷酸或長的(44bp)接頭互補性寡核苷酸(例如雜交阻斷寡核苷酸)。預期當雜交阻斷寡核苷酸反映與靶樣品連接的接頭寡核苷酸的序列的主要部分時,雜交阻斷寡核苷酸是最佳的。

在一式三份平行的實驗中證實:在存在物種特異性C0t-1?DNA的情況下,不使用阻斷劑或使用部分阻斷劑(24bp的阻斷劑)時,最初的靶序列文庫的富集較差,導致大約20%或更低的在靶讀數捕獲率(圖5)。但是,當與44bp的接頭互補的寡核苷酸(例如44bp的完全阻斷雜交寡核苷酸阻斷劑)與C0t-1一起加入到雜交中時,捕獲性能提高高達大約70%-80%的在靶捕獲序列(靶區域中讀數的百分率)。本發明不限于特定的機理。事實上,理解機理不足以實施本發明。然而,預期使用C0t-1?DNA作為阻斷劑抑制了基因組樣品序列介導的次級捕獲,而過量的雜交阻斷寡核苷酸抑制了接頭介導的次級雜交復合物。預期44bp的接頭分子與文庫中至少一半的分子形成雜交復合物(例如,最5’端的44bp和最3’端的44bp在每個分子上是相同的)?;径?,每條鏈都有機會與其互補鏈雜交,從而至少總共88bp是雙鏈的。預期阻斷寡核苷酸抑制這些分子間復合物的形成(不論其是在陣列中還是在溶液中)。此外,如果洗滌底物之后不小心遺留下任何阻斷寡核苷酸的話,產生具有不可延伸的(例如2′3′雙脫氧)3’末端的接頭阻斷寡核苷酸使LM-PCR捕獲后方法(例如擴增或測序)中的阻斷寡核苷酸不相互干擾。

在本發明的一些實施方式中,將含有變性的(單鏈的)核酸分子(優選基因組核酸分子,其可以是片段化的分子)的樣品在雜交的條件下暴露至微陣列底物上的多個寡核苷酸探針。在雜交反應過程中,本發明提供了加入阻斷DNA,特別是物種特異性阻斷DNA,其中,與在雜交過程中使用非物種特異性阻斷DNA相比,所述物種特異性阻斷DNA增加靶核酸的在靶富集(例如,引起在靶讀數增加)。

在本發明的一些實施方式中,進一步修飾含有核酸分子(優選基因組核酸分子,其可以是片段化的分子)的樣品以使片段化DNA的5’和3’末端包含接頭連接子序列。所述接頭序列可以是自我互補的,非互補的,或Y型接頭。使用接頭序列是為了例如連接介導的片段化核酸的擴增,以及用于測序目的。優選通過LM-PCR來擴增接頭連接的片段,并且在雜交的條件下暴露至微陣列底物上的多個寡核苷酸探針。在雜交反應過程中,本發明提供了加入阻斷DNA,特別是物種特異性阻斷DNA,以抑制次級雜交反應,其中,與在雜交過程中使用非物種特異性阻斷DNA相比,所述物種特異性阻斷DNA增加靶核酸的在靶富集。在一些實施方式中,在雜交過程中另外加入雜交阻斷劑寡核苷酸以抑制次級捕獲反應。預期與不使用此類阻斷序列的微陣列雜交相比,聯合加入物種特異性阻斷DNA與雜交阻斷劑寡核苷酸進一步增加在靶富集的富集。

預期本發明不受所進行的微陣列測定類型的限制,事實上其中希望抑制次級捕獲反應的任意測定都將從實施本發明的方法和系統中獲益。所述測定包括但不限于,復雜性減低和序列富集、比較型基因組雜交、比較型基因組測序、表達、染色質免疫沉淀-芯片(ChIP-芯片)、表觀遺傳學,等等。

在本發明的一些實施方式中,通過多種方法將用于捕獲靶核酸的探針固定在底物上。在一個實施方式中,探針可以點染在載玻片上(例如美國專利號6,375,903和5,143,854)。在優選的實施方式中,使用如美國專利號6,375,903、7,037,659、7,083,975、7,157,229中描述的無掩膜的陣列合成器(MAS)在底物上在原位合成探針,所述無掩膜的陣列合成器允許直接在載玻片上原位合成寡核苷酸序列。

在一些實施方式中,固體支持物是珠子或顆粒的群體。珠子可以包裝在例如柱中,從而靶樣品被裝載到柱中并通過柱,在柱中發生探針/靶樣品和阻斷核酸(例如物種特異性C0t-1?DNA和/或雜交阻斷寡核苷酸)的雜交,然后洗滌并洗脫靶樣品序列以減低遺傳復雜性并增強靶標捕獲。在一些實施方式中,為了增強雜交動力學,在包含多個探針的水溶液中進行雜交,所述探針懸浮于水性環境中。

在本發明的實施方式中,用于如本文描述的微陣列捕獲方法中的雜交探針印在或沉積在固體支持物上,例如微陣列載玻片、芯片、微孔、柱、管、珠子或顆粒。所述底物可以是例如玻璃、金屬、陶瓷、聚合物珠子等。在優選的實施方式中,固體支持物是微陣列載玻片,其中使用無掩膜的陣列合成器在微陣列載玻片上合成探針。多個寡核苷酸探針的長度可以變化,其取決于實驗設計,并且僅受到合成此類探針的可能性的限制。在優選的實施方式中,多個探針的群體的平均長度是大約20至大約100個核苷酸,優選大約40至大約85個核苷酸,特別是大約45至大約75個核苷酸。在本發明的實施方式中,雜交探針在序列上對應于基因組的至少一個區域,并且可以使用例如無掩膜的陣列合成器(MAS)技術平行地在固體支持物上提供它們。

在本發明的實施方式中,通過實施本發明的方法抑制次級捕獲不限于在特定的底物上進行抑制,例如在探針附著于底物的情況下抑制探針與非靶序列的次級捕獲。事實上,通過加入如本文描述的物種特異性阻斷DNA和/或阻斷寡核苷酸,也抑制發生于溶液中的次級捕獲。

本發明不限于用于捕獲的樣品的類型,事實上預期,所用的任何樣品都同樣適用于本發明,包括但不限于,基因組DNA或RNA樣品,cDNA文庫或mRNA文庫。在一些實施方式中,本文使用的核酸序列經過片段化,其中所述片段的平均大小是大約100至大約1000個核苷酸殘基,優選大約250至大約800個核苷酸殘基,最優選大約400至大約600個核苷酸殘基。

在本發明的實施方式中,靶核酸通常是脫氧核糖核酸或核糖核酸,并且包括通過將一種核酸分子類型(例如DNA、RNA和cDNA)轉化為另一種類型而在體外合成的產物,以及包含核苷酸類似物的合成分子。具體而言,片段化的基因組DNA分子是比天然存在的基因組核酸分子短的分子。技術人員可以使用熟知的方法通過化學、物理或酶學片段化處理或切割而從較大的分子產生隨機的或非隨機大小的分子。例如,化學片段化處理可以使用含鐵金屬(例如Fe-EDTA)。物理方法可以包括超聲、水動力(hydrodynamic?force)或霧化(例如,參見歐洲專利申請EP?0?552?290)。酶學方法可以使用核酸酶和部分消化反應,例如微球菌核酸酶(例如Mnase)或核酸外切酶(例如Exo1或Bal31)或限制性核酸內切酶。

可能包含靶核酸序列的核酸分子的群體優選含有生物的完整基因組或至少一條染色體,或具有至少大約100kb的至少一個核酸分子。特別地,所述核酸分子的大小是至少大約200kb,至少大約500kb,至少大約1Mb,至少大約2Mb或至少大約5Mb,尤其是,大小為大約100kb至大約5Mb,大約200kb至大約5Mb,大約500kb至大約5Mb,大約1Mb至大約2Mb,或大約2Mb至大約5Mb。在一些實施方式中,核酸分子是基因組DNA,在其它實施方式中,核酸分子是cDNA或RNA種類(例如tRNA、mRNA、miRNA)。

在本發明的實施方式中,可能包含或可能不含靶核酸序列的核酸分子可以選自動物、植物或微生物。在一些實施方式中,如果僅能獲得有限的核酸分子樣品,則在實施本發明的方法之前將該核酸擴增(例如通過全基因組擴增)。例如,預先擴增可能對于執行本發明的用于法醫目的(例如,法醫醫藥)的實施方式是必要的。

在一些實施方式中,核酸分子的群體是基因組DNA分子的群體。雜交探針和隨后的擴增子可以包含一個或多個序列,其靶向來自一個或多個(例如多個)遺傳基因座的一個或多個(例如多個)外顯子、內含子或調節序列,至少一個單一遺傳基因座的完整序列,所述基因座的大小為至少100kb,優選至少1Mb,或至少一個如上文指定的大小,已知含有SNP的位點,或確定陣列(尤其是tiling陣列)的序列,所述陣列經設計以捕獲至少一條完整染色體的完整序列。在一些實施方式中,僅使用一個雜交探針序列來捕獲靶序列。事實上,本發明不限于用于捕獲靶核酸的不同探針序列的數目。

預期從包括來自任意來源的核酸(純化的或非純化的形式)的一個或多個樣品富集靶核酸序列。所述來源不需要包含來自生物體的基因組核酸分子的完整互補物。所述樣品優選來自生物來源,包括但不限于,來自個體患者的分離體、組織樣品或細胞培養物。靶區域可以是數個MB的一個或多個連續段,或數個較小的連續或不連續區域,例如來自一條或多條染色體的全部外顯子,或已知含有SNP的位點。例如,包含一個或多個不同的序列和隨后的探針衍生的擴增子的一個或多個雜交探針可以支持這樣的陣列(例如,非tiling陣列或tiling陣列):所述陣列被設計為捕獲一條或多條完整染色體、一條或多條染色體的一部分、一個外顯子、所有外顯子、來自一條或多條染色體的所有外顯子、選定的一個或多個外顯子、一個或多個基因的內含子和外顯子、基因調節區,等等。

或者,為了增加需要的非獨特性或難以捕獲的靶標被富集的可能性,可以使探針針對與實際靶序列相關的序列(例如處于相同的片段上,但間隔開),在這種情況下包含需要的靶標和相關的序列的基因組片段將被捕獲并富集。所述相關的序列可以與靶序列相鄰或間隔開,但是技術人員將認識到,兩個部分彼此越靠近,基因組片段同時含有這兩個部分的可能性越大。

在本發明的一些實施方式中,所述方法包括以下步驟:將接頭或連接子分子連接至片段化的核酸分子的一個或兩個末端,然后變性并與探針雜交。在本發明的一些實施方式中,所述方法還包括使用至少一個引物擴增所述經接頭修飾的核酸分子,所述引物包含與所述接頭分子的序列特異性雜交的序列。在本發明的一些實施方式中,在片段化的核酸分子的一個或兩個末端提供雙鏈接頭,然后進行樣品變性并與探針雜交。在此類實施方式中,在洗脫之后擴增靶核酸分子以產生擴增產物庫,所述擴增產物相對于原始樣品而言具有進一步降低的復雜性??梢允褂美绶翘禺愋赃B接介導的PCR(LM-PCR)通過多輪擴增來擴增靶核酸分子,如果需要的話,可以通過針對微陣列探針的一輪或多輪選擇進一步富集產物。根據復雜性減低步驟之后的下游分析應用的需要來提供連接子或接頭,例如,可以是任意大小,具有任意核酸序列。接頭連接子可以介于大約12至大約100個堿基對,包括大約18至100個堿基對的范圍,優選大約20至44個堿基對。在一些實施方式中,所述連接子是自我互補的,非互補的,或Y接頭。

接頭分子的連接允許進行經捕獲的分子的后續擴增的步驟。與連接發生在捕獲步驟之前還是之后無關,存在數個替代性實施方式。在一個實施方式中,連接一種類型的接頭分子(例如接頭分子A),其導致產生在片段的兩個末端具有相同末端序列的片段群體。結果是,在潛在的后續擴增步驟中僅使用一個引物就足夠了。在替代性實施方式中,使用兩種類型的接頭分子A和B。這導致產生由3種不同類型組成的富集分子群體:(i)在一個末端具有一種接頭(A)并且在另一個末端具有另一種接頭(B)的片段;(ii)在兩個末端都具有接頭A的片段;和(iii)在兩個末端都具有接頭B的片段。如果例如使用454?Life?Sciences?Corporation?GS20和GS?FLX儀器(例如參見GS20?Library?Prep?Manual,2006年12月,WO?2004/070007;通過引用方式全文并入本文)進行擴增和測序,則產生具有接頭的富集分子具有很大的益處。

在本發明的實施方式中,方法、系統和組合物包括將物種特異性阻斷DNA摻入到微陣列測定的雜交反應中以抑制次級捕獲。在一些實施方式中,物種特異性阻斷DNA是來自任意物種的C0t-1?DNA,包括但不限于哺乳動物物種、植物物種、非哺乳動物物種、細菌物種、酵母物種等。在本發明的一些實施方式中,當用于雜交的靶核酸序列是人核酸序列時,微陣列雜交反應包括人C0t-1。在本發明的一些實施方式中,當靶核酸序列是鼠核酸序列時,微陣列包括鼠C0t-1。在本發明的一些實施方式中,當靶核酸序列是植物核酸序列時,微陣列包括植物C0t-1。預期本發明不限于任意特定的植物物種。用于本發明的植物物種的實例包括但不限于,經濟上和/或研究上相關的植物物種,例如玉米、大豆、高梁、小麥、蔬菜作物、水果作物、飼料作物、禾本科植物、闊葉樹植物和任何其它雙子葉和/或單子葉植物。

在本發明的實施方式中,方法、系統和組合物包括將雜交阻斷寡核苷酸摻入到微陣列測定的雜交反應中以抑制接頭介導的次級捕獲。在一些實施方式中,雜交阻斷寡核苷酸與來自任意物種的物種特異性阻斷DNA聯合使用,所述物種包括但不限于哺乳動物物種、植物物種、非哺乳動物物種、細菌物種、酵母物種等。在一些實施方式中,雜交阻斷寡核苷酸的序列源自連接至片段化核酸的一個或多個接頭分子的序列。在一些實施方式中,雜交阻斷寡核苷酸的序列包括一個或多個接頭分子的全部序列,而在其它實施方式中,雜交阻斷寡核苷酸的序列包括一個或多個接頭分子的序列的片段。在本發明的一些實施方式中,當用于雜交的靶核酸序列是人核酸序列時,微陣列雜交反應包括人C0t-1并聯合雜交阻斷寡核苷酸。在本發明的一些實施方式中,當靶核酸序列是鼠核酸序列時,微陣列包括鼠C0t-1并聯合雜交阻斷寡核苷酸。在本發明的一些實施方式中,當靶核酸序列是植物核酸序列時,微陣列包括植物C0t-1并聯合雜交阻斷寡核苷酸。預期本發明不限于任意特定的植物物種。用于本發明的植物物種的實例包括但不限于,經濟上和/或研究上相關的植物物種,例如玉米、大豆、高粱、小麥、蔬菜作物、水果作物、飼料作物、禾本科植物、闊葉樹植物和任何其它雙子葉和/或單子葉植物。

在一些實施方式中,本發明包括試劑盒,其包含用于執行根據本發明的方法的試劑和材料。此類試劑盒可以包含一種或多種微陣列底物,在所述底物上固定了特異性針對來自一個或多個靶遺傳基因座的一個或多個靶核酸序列的多個雜交探針(例如對外顯子、內含子、SNP序列等有特異性)、確定tiling陣列的多個探針,所述tiling陣列設計為用于捕獲至少一條完整染色體的完整序列,擴增引物、用于執行聚合酶鏈式反應方法的試劑(例如鹽溶液、聚合酶、dNTP、擴增緩沖液等)、用于執行連接反應的試劑(例如連接接頭、T4多核苷酸激酶、T4?DNA連接酶、緩沖液等)、物種特異性阻斷DNA、雜交阻斷寡核苷酸、試管、雜交溶液、洗滌溶液、洗脫溶液、磁鐵和試管架。在一些實施方式中,試劑盒還包括兩個或更多個不同的雙鏈接頭分子。

在一些實施方式中,試劑盒包含選自下列的至少一個或多個化合物:DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶、T4DNA連接酶、一種或多種陣列雜交溶液,和/或一種或多種陣列洗滌溶液。在優選的實施方式中,本發明的試劑盒中包括三種洗滌溶液,所述洗滌溶液包含SSC、DTT和任選的SDS。例如,本發明的試劑盒包含洗滌緩沖液I(0.2%SSC,0.2%(v/v)SDS,0.1mM?DTT),洗滌緩沖液II(0.2%SSC,0.1mM,DTT)和/或洗滌緩沖液III(0.05%SSC,0.1mM?DTT)。在一些實施方式中,本發明的系統還包括洗脫溶液,例如水或含有TRIS緩沖液和/或EDTA的溶液。

實驗

提供了以下實施例以證明并進一步解釋本發明的一些優選的實施方式和方面,不應被解釋為限制其范圍。

實施例1-人和小鼠DNA的富集和測序

使用小鼠和/或人樣品的實驗沿用已經建立的微陣列分析程序,使用C0t-1DNA以阻斷次級捕獲。本文使用的程序和方法的實例見NimbleGen?Arrays?User’s?Guide;Sequence?Capture?Array?Delivery(Roche?NimbleGen,Inc.)和454BioSciences?GS?GLX?Shotgun?DNA?Library?Preparation?Method?Manual(454BioSciences),二者皆通過引用方式全文并入本文。

實施例2-玉米C0t-1的產生

將3個加熱器干浴器設定在105℃、65℃和37℃。將300μg玉米DNA在2ml?Dolphin鼻管中的總體積為420μl的水中進行超聲處理。探針的超聲處理總共進行3次。超聲處理之后,加入30μl?5M?NaCl和50ul水,使總體積達到500μl(0.3M?NaCl),以產生大約1ng/μl?DNA濃度。

將稀釋的樣品管在最熱的加熱器中加熱10分鐘,然后將管迅速離心并在65℃溫育19分鐘,然后加入60ul?10X綠豆核酸酶緩沖液(Promega?Corporation,Madison?WI)和36.6μl室溫的水。每微克DNA加入1單位(1U)綠豆核酸酶。將反應物旋渦,離心沉淀下來,并在37℃溫育10分鐘。溫育之后,加入1.2mlZymo?DNA結合緩沖液(Zymo?Research),將管旋渦,將DNA溶液(150μl)分散進入每個12Zymo?25μg凈化柱,并洗滌該柱。將DNA從柱上洗脫進入35μl水中。通過260/280比(至少為1.7)驗證DNA樣品純度,通過瓊脂糖凝膠電泳進一步測定樣品等份試樣,以檢查降解情況。

實施例3-接頭連接的人DNA文庫和測定

產生接頭寡核苷酸并與片段化的人DNA的末端連接。合成接頭寡核苷酸A、A’、B和B’并重懸于Tris-EDTA緩沖液,達到400μM的濃度(*-硫代磷酸酯鍵,/5BioTEG/-5′生物素-TEG)。

接頭A(SEQ?ID?NO:1):

C*C*A*T*CTCATCCCTGCGTGTCCCATCTGTTCCCTCCCTGTC*T*C*A*G

接頭A’(SEQ?ID?NO:2):C*T*G*A*GACA*G*G*G*A

接頭B:(SEQ?ID?NO:3)

/5BioTEG/C*C*T*

A*TCCCCTGTGTGCCTTGCCTATCCCCTGTTGCGTGTC*T*C*A*G

接頭B’(SEQ?ID?NO:4):C*T*G*A*GACA*C*G*C*A

將寡核苷酸A&A’以及B&B’(5μl?400μM連接子溶液)等分進入2個單獨的PCR管中,加入90μl退火緩沖液(500μl?1M?Tris-HCl(pH?7.8)中的250μl?1MMgOAc,在總體積為50ml的水中),以產生20μM寡核苷酸接頭的溶液(A&A’,B&B’)。將等量的20μM接頭溶液混合在一起,并使用以下程序退火:95℃,1分鐘;梯度溫度為0.1℃/秒,直至15℃,使溫度降低至4℃,儲存于-20℃。

使用霧化器將基因組DNA樣品片段化。將總體積為100μl?TE中的DNA樣品(5μg)與500μl冰冷的霧化緩沖液(53.1%甘油、37mM?Tris-HCl、55mMEDTA(pH?7.5),在水中)混合在一起。使非反應性氣體通過DNA溶液(45psi),持續1分鐘。將2ml?PBI緩沖液(Qiagen)加入到霧化的樣品中,將樣品分開并施加至Qiagen?MinElute柱(2),以25μl洗脫緩沖液(EB,Qiagen)洗脫,將洗脫的樣品重新混合在一起,將最終體積調整為50μl。

通過加入35μl珠子(Bioscience?Corporation)將小片段(大約250bp或更小)從霧化樣品中除掉,在室溫溫育5分鐘,以乙醇洗滌珠子(以500μl洗滌2次),將珠子在37℃干燥大約4分鐘,通過加入25μl?EB洗脫珠子捕獲的片段化的樣品DNA。使用T4多核苷酸激酶和T4DNA聚合酶根據已建立的程序(Molecular?Cloning;A?Laboratory?Manual,Sambrook等人編輯,Cold?Spring?Harbor?Press)將捕獲的片段化的DNA的末端拋光。

將接頭復合物連接至拋光的DNA片段。將50μl拋光的DNA加入到Quick?LigationTM反應物(New?England?BioLabs,Inc.)中:60μl?2X?Quick連接緩沖液、5μl10μM接頭溶液和5μl?Quick連接酶。將連接反應物在25℃溫育15分鐘。連接之后,通過以下步驟從反應成分中純化接頭連接的樣品DNA片段:加入600μlPBI,將溶液施加至MinElute柱(Qiagen),離心1分鐘(16Kxg),加入750μl?PE緩沖液(Qiagen),離心1.5分鐘(16Kxg),通過再次離心1分鐘使柱干燥,加入26μl?EB,并將柱在室溫溫育1分鐘,通過最后離心1分鐘(16Kxg)將純化的接頭連接的DNA文庫片段從所述柱中洗脫出來。

在DNA接頭連接的文庫上進行連接介導的PCR(LM-PCR)。簡而言之,使用Pfu?DNA聚合酶,使用特異于連接子序列的引物來擴增片段。

引物A??5’ATCTCATCCCTGCGTGTCCCATCT?3’(SEQ?ID?NO:5)

引物B??5’TATCCCCTGTGTGCCTTGCCTATC?3’(SEQ?ID?NO:6)

進行聚合酶鏈式反應:95℃,2分鐘;12個以下循環:95℃,30秒,63.5℃,30秒,72℃,1分鐘;最后在72℃延伸1分鐘,并儲存在4℃。按照以上描述使用QIAquick柱純化擴增產物。確定樣品濃度和擴增大小范圍。樣品范圍通常介于300-1000bp,其A260/280比為1.7-2.0之間。

使用來自Roche?NimbleGen,Inc.的雜交系統和試劑,根據生產商的說明書,例如見NimbleGen?Arrays?User’s?Guide;Sequence?Capture?Array?Delivery(Roche?NimbleGen,Inc.)(通過引用方式全文并入本文),使擴增的樣品雜交至微陣列。簡而言之,將100μl人C0t-1?DNA加入至5μg接頭連接的片段化的人DNA?;蛘?,在一些實驗中,通過加入長度為44bp或24bp的實驗性雜交阻斷寡核苷酸(/ddC/-胞苷2’3’雙脫氧核糖核苷酸)補充C0t-1?DNA:

雜交阻斷寡聚體A44(SEQ?ID?NO:7):

CCATCTCATCCCTGCGTGTCCCATCTGTTCCCTCCCTGTCTCAG/ddC/

雜交阻斷寡聚體B44(SEQ?ID?NO:8):

CCTATCCCCTGTGTGCCTTGCCTATCCCCTGTTGCGTGTCTCAG/ddC/

雜交阻斷寡聚體A24(SEQ?ID?NO:9):

ATCTCATCCCTGCGTGTCCCATCT/ddC/

雜交阻斷寡聚體B24(SEQ?ID?NO:10):

TATCCCCTGTGTGCCTTGCCTATC/ddC/

將樣品干燥、復水合、變性并施加至微陣列,在42℃雜交大約48小時。洗滌并洗脫富集的人DNA。

按照以上描述將富集的樣品DNA進行捕獲后LM-PCR,不同之處在于擴增循環進行24次。按照以上描述使用QIAquick柱純化經擴增的樣品。

制備用于測序的富集的連接子接頭的人文庫DNA樣品,并在454BioSciences?GS?FLX系統上測序。用于制備用來測序的樣品的方法見例如454BioSciences?GS?GLX?Shotgun?DNA?Library?Preparation?Method?Manual,通過引用方式全文并入本文。

本申請中提及的所有公開物和專利通過引用方式并入本文。不脫離本發明的范圍和精神,本發明所描述的方法和組合物的多種修飾和變體對于本領域技術人員是顯而易見的。雖然通過具體的優選實施方式描述了本發明,但是應該理解所要求保護的本發明不應該被不適當地局限于這些具體實施方式。事實上,那些對于相關領域技術人員而言顯而易見的用于實施本發明的所描述的模式的多種變體意在包括在隨附的權利要求的范圍內。

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陣列 測定 中的 次級 捕獲 抑制
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