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海南捕鳥蛛毒素-XXI及其在制備鎮痛消炎藥物和制備研究TRPV1通道試劑中的應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201110288942.0

申請日:

20110927

公開號:

CN102321165A

公開日:

20120118

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:

IPC分類號:

C07K14/435,A61K38/17,A61P29/00

主分類號:

C07K14/435,A61K38/17,A61P29/00

申請人:

湖南師范大學

發明人:

曾雄智,梁宋平,陳仁忠,王賢純,陳平,黃德雄,劉中華

地址:

410081 湖南省長沙市麓山南路175號

優先權:

CN201110288942A

專利代理機構:

長沙永星專利商標事務所

代理人:

周詠;米中業

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內容摘要

本發明公開了一種海南捕鳥蛛毒素-XXI及其在制備鎮痛消炎藥物和制備研究TRPV1通道試劑中的應用。海南捕鳥蛛毒素-XXI(海南捕鳥蛛毒素-XXI)是由64個氨基酸殘基組成的多肽,含有8個半胱氨酸及4對二硫鍵,其相對分子質量是6868.095。該毒素分子能激活辣椒素受體而對電壓依賴性的各鈉,鉀通道亞型沒有任何作用,顯示良好的專一性,故該毒素分子具有開發成為研究TRPV1通道的良好工具試劑的潛在應用前景。此外該分子最大的特點就是能持續地激活TRPV1通道,使鈣離子內流細胞長時間興奮從而對外界刺激不再敏感,因此該分子具有鎮痛消炎的效果。

權利要求書

1.一種海南捕鳥蛛毒素-XXI,其特征是該捕鳥蛛毒素-XXI的氨基酸序列如下:Ala?Cys?Ser?Lys?Gln?Ile?Gly?Asp?Lys?Cys?Lys?Arg?Asn?Cys?Glu?Cys?1???????????????5???????????????????10??????????????????15??????Cys?Gly?Lys?Thr?Val?Val?Cys?Gly?Thr?Ile?Tyr?Val?Gly?Gly?Lys?Glu?????????????20??????????????????25??????????????????30??????????Val?Asn?Gln?Cys?Met?Asp?Lys?Thr?Ser?Asp?Asn?Ala?Ile?Leu?Asn?Gly?????????35??????????????????40??????????????????45??????????????Leu?Gly?Lys?Gly?Met?Asn?Phe?Ile?Glu?Asn?Thr?Phe?Ser?Phe?Cys?Val?????50??????????????????55??????????????????60??????????????????。2.一種根據權利要求1所述海南捕鳥蛛毒素-XXI在制備鎮痛消炎藥物中的應用。3.一種根據權利要求1所述海南捕鳥蛛毒素-XXI在制備TRPV1通道工具試劑的應用。

說明書

技術領域

本發明涉及一種海南捕鳥蛛毒素-XXI及其在制備鎮痛藥物中的應用和在制備研究TRPV1通道的良好工具試劑中的應用。

背景技術

1997年成功克隆的辣椒素受體即TRPV1是近年來科學家們研究的“熱點分子”,?它是機體內一個重要的傷害性感受分子,參與機體內眾多生理和病理過程,并與某些疾病的發生有著密切的聯系,因此TRPV1是許多新藥研發的靶點分子(如鎮痛藥)。對該通道的研究主要集中在對它的激動劑和拮抗劑的篩選以及與它相關疾病機制方面的研究。由于辣椒素類物質的強烈刺激性,限制了這一類物質的臨床應用,因此,開發刺激性小,水溶性強的辣椒素受體相互作用分子成為該通道新藥研發的重要方向。

發明內容

本發明旨在提供一種專一性地激活辣椒素受體(TRPV1)通道的海南毒素-XXI。

本發明提供的這種海南毒素-XXI?(海南捕鳥蛛毒素-XXI),其氨基酸序列如下:

Ala?Cys?Ser?Lys?Gln?Ile?Gly?Asp?Lys?Cys?Lys?Arg?Asn?Cys?Glu

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Cys?Cys?Gly?Lys?Thr?Val?Val?Cys?Gly?Thr?Ile?Tyr?Val?Gly?Gly

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Ser?Phe?Cys?Val。

本發明涉及的海南捕鳥蛛毒素-XXI是由64個氨基酸殘基組成的多肽,含有8個半胱氨酸及4對二硫鍵,其相對分子質量是6868.095。該毒素分子的理化性質是:純化凍干的樣品為白色疏松粉末,無氣味,易溶解于水,水溶液近于無色透明;膜片鉗電生理實驗證明該毒素分子能激活辣椒素受體而對電壓依賴性的各鈉,鉀通道亞型沒有任何作用,顯示良好的專一性,故該毒素分子具有開發成為研究TRPV1通道的良好工具試劑的潛在應用前景。此外,與其它已發現的激活劑相比較,該分子最大的特點就是能持續地激活TRPV1通道,使鈣離子內流細胞長時間興奮從而對外界刺激不再敏感,因此該分子具有鎮痛消炎的效果。

附圖說明

圖1是海南捕鳥蛛粗毒的RP-HPLC色譜圖,星號所標記的為目標分子所在的組份。

圖2是粗毒活性組份的進一步RP-HPLC(分析型),箭頭所示為海南捕鳥蛛毒素-XXI的色譜峰。

圖3是海南捕鳥蛛毒素-XXI的質譜鑒定圖譜。

圖4是海南捕鳥蛛粗毒對辣椒素受體的激活作用。

圖5是海南捕鳥蛛毒素-XXI激活辣椒素受體,產生能被釕紅阻斷的鈣電流,并呈現濃度依賴性。

圖6是海南捕鳥蛛毒素-XXI能持久地激活辣椒素受體。

圖7是海南捕鳥蛛毒素-XXI對TTX-R,Kv2.1和Kv4.2的抑制作用。

具體實施方式

發明過程所涉及的材料,儀器,方法和結果(結合附圖具體說明)

1.?海南捕鳥蛛毒素-XXI的分離純化,質譜鑒定及序列確定。

1.1?粗毒采集

在一個固定的鐵架臺上,用50?ml?EP管作為毒液接收器,用大鑷子從側面夾住海南捕鳥蛛的腹部,使蜘蛛張開螯爪并伸入管中,然后用5~10?V的脈沖電壓刺激兩螯肢基部外側3~5s。蜘蛛感受電刺激后,即用觸肢緊緊抱住管壁,同時將螯爪有力刺向管內壁并射出毒液。毒液用微量注射器抽取收集后,放入-40℃冷凍干燥機中經真空冷凍干燥成淺黃色粉末即為粗毒。

1.2?反相HPLC分離純化與制備

每次稱取50?mg海南捕鳥蛛粗毒粉末用10?ml?Q水充分溶解,配置成5?mg/mL的粗毒樣液,用10000g的轉速離心10?min后取上清液,然后用0.22微米的過濾器進行過濾,上清液在Waters?515半制備型HPLC上分離純化,每次上樣5?mg左右的樣品。在2487紫外檢測器上以215?nm和280?nm兩個波段檢測,色譜柱為顆??讖?0微米的反相柱,型號為Phenomenex?10?×?250?mm?C18?(10?mm)柱。以乙腈為流動相進行分離,梯度為:(洗脫液A:含0.1%?TFA的ddH2O;B液:含0.1%?TFA的乙腈,?B液0%-20%?10?min,?30%-40%?24min;?流速?3.0?mL/min),?柱溫40℃,具體色譜圖(如圖1,215?nm)。圖中星號所示為活性組份,收取凍干目標峰在分析型2695?alliance色譜儀上進行進一步的分離純化,2489?檢測器在215nm和280nm兩個波段檢測;?色譜柱為顆??讖?微米的反相柱,型號為phenomenex?Jupiter?Proteo?10′?250?mm;以乙腈為流動相(洗脫液A:含0.1%?TFA的ddH2O;B液:含0.1%?TFA的乙腈,B液0%-30%?10?min,?30%-40%?10?min),流速為1.0?mL/min,柱溫設定為30℃.其分析型色譜圖(如圖2,215nm),箭頭所示單一峰為海南捕鳥蛛毒素-XXI。

1.3?質譜鑒定

經過第二輪分析型色譜分離的毒素樣品凍干后為白色疏松粉末,無氣味,易溶解于水,水溶液近于無色透明。應用MALDI-TOF/TOF(UltraFlex,?德國Bruker公司)質譜鑒定其相對分子量。具體實驗步驟:用0.1℅三氟乙酸、50℅乙腈、50℅Q水混合液制備CCA(α-cyano-4-hydroxyc-innamic?acid)?基質液(5?mg/mL),充分混合后10000g離心10分鐘,然后分別取?1?mL被測樣品(可以直接是色譜儀上接收的樣液)與4?mL?CCA?基質上清液混合,取1?mL混合液點樣于質譜儀的樣品板上,室溫下自然風干后測定分子量。儀器工作環境:線性模式、離子源加速電壓是20kV、N2激光波長337nm、脈沖寬度3ns、離子延遲提取150ns、真空度4′10-7?Torr。質譜信號單次掃描累加50次,正離子測定模式,質譜結果使用外標(混合標準樣品)校正。經測定其為單一組分并測得準確分子量為6868.095?Da(如圖3),純度在99%以上。

1.4?氨基酸序列確定

海南捕鳥蛛毒素-XXI的測序是在491-A測序儀上完成的,它是利用了Edman降解測序的原理通過偶聯,環化裂解,轉化三個步驟的循環來一個一個測定氨基酸的序列的。具體來說就是通過異硫氰酸苯脂(PITC)與蛋白質或者多肽的N-端殘基的偶聯,苯氨基硫甲酰酞(PTC-肽)環化裂解,和噻唑呤酮苯氨(ATZ)轉化為苯異硫尿氨基酸(PTH-氨基酸)三個主要的化學步驟,每個循環從蛋白質或者多肽裂解一個氨基酸殘基,然后暴露出新的游離的氨基酸以進行下一個Edman降解,最后通過每一輪的PTH-氨基酸鑒定實現蛋白質序列的測定。海南捕鳥蛛毒素-XXI經測定由64個氨基酸殘基組成,含有8個半胱氨酸及其不常見的4對二硫鍵。經序列推斷的分子量與質譜鑒定的分子量是相匹配的。為了進一步確定序列的準確性,我們設計引物從實驗室已知海南捕鳥蛛文庫中調出海南捕鳥蛛毒素-XXI的前體cDNA序列,經翻譯后該分子前體總共由109個氨基酸構成,含有信號肽(18個氨基酸殘基),前導肽(27個氨基酸殘基),成熟肽(64個氨基酸殘基,紅色標記),其中成熟肽與測定的序列完全匹配。

2.?海南捕鳥蛛毒素-XXI的電生理活性鑒定

通過質譜及其Edman降解測序了解了海南捕鳥蛛毒素-XXI的分子量及其初級結構序列,為了揭示該毒素分子的作用,我們利用膜片鉗技術檢測了該分子對辣椒素受體的作用及其特點,還檢測了該分子對電壓依賴性鈉,鉀通道的抑制作用,結果表明該毒素分子是專一性地辣椒素受體激動劑。(全細胞模式電生理實驗儀器型號是:美國Axon公司的MultiClamp?700B)

2.1?海南粗毒對辣椒素受體的激活作用

采用海南捕鳥蛛粗毒刺激表達在HEK293T細胞上的辣椒素受體,結果發現100?mg/L的海南粗毒能顯著地激活TRPV1通道,產生很大的內向電流(如圖4)

2.2?海南捕鳥蛛毒素-XXI激活辣椒素受體,呈現濃度依賴性

海南捕鳥蛛毒素-XXI對辣椒素受體(TRPV1)的激活作用(如圖5):從右圖上可以看到3?μM海南捕鳥蛛毒素-XXI能緩慢刺激出內向電流,?10?μM?海南捕鳥蛛毒素-XXI能刺激較大的內向電流,30?μM?海南捕鳥蛛毒素-XXI能刺激更大的內向電流;左圖為海南捕鳥蛛毒素-XXI對辣椒素受體的激活的藥效曲線,其半激活濃度為25μM,電流并能被10?μM釕紅(RR)迅速阻斷。該分子對辣椒素受體的激活呈現慢激活,而辣椒素對TRPV1的激活呈現快激活快失活,該分子對TRPV1的激活作用強度明顯低于辣椒素的激活活性。?

2.3?海南捕鳥蛛毒素-XXI持久地激活辣椒素受體

海南捕鳥蛛毒素-XXI一個明顯的特點就是能持續激活TRPV1通道(如圖6):從圖上可以看出10?μM?海南捕鳥蛛毒素-XXI至少能持續地激活辣椒素受體8分鐘,由于細胞長時間興奮從而對外界刺激(包括傷害性刺激)不敏感,因此該分子可能有鎮痛的效果,具有開發成鎮痛藥的前景。

2.4?海南捕鳥蛛毒素-XXI的專一性分析

本實驗開展了該毒素分子對離子通道作用的專一性研究,以膜片鉗電生理實驗技術為平臺,研究了海南捕鳥蛛毒素-XXI對瞬時表達于HEK293T細胞的各鈉鉀離子通道亞型(kv1.1,kv1.2,kv1.3,kv2.1,kv4.2,kv4.3,Nav1.4,Nav1.5)及SD大鼠背根神經節細胞上表達的鈉通道電流具有抑制作用。實驗結果證明該毒素分子顯示良好的專一性,對電壓依賴性的各鈉,鉀通道都沒有作用,只能激活辣椒素受體,因此該分子又具有開發成為研究TRPV1通道工具試劑的潛在應用前景(如圖7)。

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海南 捕鳥蛛 毒素 XXI 及其 制備 鎮痛 消炎 藥物 研究 TRPV1 通道 試劑 中的 應用
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