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家蠶生產重組犬CaIFN的方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN200610053280.8

申請日:

20060906

公開號:

CN1916175A

公開日:

20070221

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:

IPC分類號:

C12N15/21,C12N15/866,C12P21/02

主分類號:

C12N15/21,C12N15/866,C12P21/02

申請人:

浙江大學

發明人:

姚慧鵬,吳小鋒,趙娜

地址:

310027浙江省杭州市西湖區浙大路38號

優先權:

CN200610053280A

專利代理機構:

杭州求是專利事務所有限公司

代理人:

林懷禹

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內容摘要

本發明公開了一種家蠶生產重組犬CaIFN-α的方法。利用家蠶桿狀病毒作為載體,構建了重組含有犬CaIFN-α基因的重組病毒。利用家蠶作為重組桿狀病毒的宿主,表達了具有生物活性的重組犬CaIFN-α。解決了CaIFN-α在大腸桿菌中表達需要復雜的復性操作、酵母表達中質粒轉化體不穩定和在哺乳動物培養細胞生產的成本太高的缺點,家蠶幼蟲表達的重組犬CaIFN-α大部分被分泌進血淋巴中,非常有利于蛋白質的快速提取。實驗結果證明利用重組桿狀病毒以家蠶生產重組犬CaIFN-α方法可行。重組犬CaIFN-α的大量生產為CaIFN-α在醫學和治療領域上的應用開辟了廣闊的前景。

權利要求書

1、一種家蠶生產重組犬CaIFN-α的方法,其特征在于:(1)CaIFN-α基因的克?。阂哉憬‘數丶胰难毎樘岬幕蚪MDNA為模板,利用PCR技術擴增得到犬CaIFN-α基因;引物設計如下:正向引物:5’ggatcctgcc?acctgcccgac3’BamHI,含有BamHI酶切位點,反向引物:5’aagctttcatttcctcctcct?g?3’,含有HindIII酶切位點;PCR反應的循環數、溫度和時間的設計如下:一個循環,94℃模板變性3分鐘;以下30個循環,94℃變性50秒,55℃退火30秒,72℃延伸2分鐘;最后1個循環,72℃延伸10分鐘;利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產物分析,并用Qiagene的PCR純化試劑盒純化,隨后將目的PCR產物克隆進Invitrogen公司的TA克隆3.9kb的載體pCR2.1,利用雙脫氧鏈終止法在核苷酸測序儀上測序確認克隆CaIFN-α基因順序正確性,并已登錄國際基因數據庫GenBank,登錄號DQ520882;(2)含有犬CaIFN-α基因的重組桿狀病毒的構建:用限制性內切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1-CaIFN-α得到CaIFN-α基因片段,然后克隆入申請人已經構建成功的家蠶Bacmid,(專利號200310108781.8)的質粒pFastBacHT獲得重組體pFastBacHT-CaIFN-α;將該質粒轉化入感受態大腸桿菌DH10BmBacmid,通過細菌轉座子的作用在細菌內產生重組病毒基因組,通過挑選重組白色菌斑,隨后抽提DNA,該DNA即為重組桿狀病毒基因組;然后將該DNA與脂質體混合,并轉染入家蠶培養細胞BmN,用無血清的TC-100培養基培養24小時后,換成含有10%胎牛血清的新鮮培養基,27℃培養5天,收集培養基上清作為病毒儲存原液,然后通過再次感染細胞獲得高濃度的重組病毒溶液,濃度為10pfu/ml,申請人將此重組病毒命名為BmNPV-CaIFN-α;(3)家蠶體內表達和重組CaIFN-α純化:使用家蠶幼蟲5齡起蠶,接種上述重組病毒進行感染表達;接種前,將幼蟲浸在冰水浴中麻醉10分鐘,注射用病毒懸浮液濃度為10pfu/ml,采用皮下注射的方法,每條家蠶注射20μl,注射1小時后給桑,在23-25℃下飼養;感染后的三天內,看不到明顯的癥狀,到第四天,幼蟲開始食欲減弱,漸漸地呈現出感染癥狀;感染后地五天或第六天,感染的幼蟲大部分死亡,在此之前收集家蠶幼蟲;將幼蟲的血淋巴作為重組犬CaIFN-α純化的起始材料,使用以下方法收集血淋巴:在15ml收集管的上方,將幼蟲向背面彎曲,用一只手固定幼蟲的頭部和尾部,讓腹部和腹足伸向外邊,用石蠟膜密封的25號針頭刺破腹足收集血液,讓血液直接滴進收集管中,為了防止血液氧化變黑,預先加入1/10體積的10mmol/L二硫蘇糖醇DTT,使其終濃度為1mmol/L;由于重組蛋白N-末端帶有6×His尾巴,可以用Ni-NTA親和柱在非變性條件下進行蛋白純化;從感染的幼蟲收集的血淋巴用非變性結合緩沖液,NaPO50mmol/L,NaCl?0.5mol/L,pH8.0,進行稀釋;樣品隨后結合于Ni-NTA柱,最后,重組蛋白用含有250mmol/L咪唑的非變性洗脫緩沖液洗脫,通過SDS-PAGE考馬斯亮藍染色后鑒定重組蛋白;(4)重組CaIFN-α活性分析鑒定:將純化的、倍比稀釋的重組CaIFN-α添加到犬腎細胞(MDCK)單層培養細胞,作用18h,然后加入VSV病毒,同時設置陰性對照組,24h后觀察細胞病變結果,根據結果分析判斷重組CaIFN-α的抗病毒活性。

說明書

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技術領域

本發明涉及DNA重組技術、蛋白質的純化與活性分析,尤其涉及一種家蠶 生產重組犬CaIFN-α的方法。

背景技術

干擾素(Interferon,IFN)是由脊椎動物細胞產生的一類分泌型糖蛋白,它具 有廣譜抗病毒和增強免疫應答的作用,其主要活性是抗病毒。犬的α干擾素 (CaIFN-α)全基因為561個堿基,編碼187個氨基酸,其中前23個氨基酸為信號肽, 后164個氨基酸為成熟蛋白,蛋白分子量約為19kDa。Hiummler等于1987年首先 開始了犬IFNα基因的研究。報道了IFNα基因序列并專利控制了該基因的使用, 而國內這方面研究較少。

近年來,養犬業在我國發展迅速,犬作為寵物飼養已成為人們生活的一部 分,而病毒病卻嚴重危害著犬的健康和生存。為了研制和開發犬重組干擾素生 物制劑,本申請對CaIFN-α基因進行了克隆.測序,并建立了利用我國的特色 資源昆蟲家蠶表達、生產重組犬α干擾素的技術,為重組犬α干擾素的應用奠定 基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種家蠶生產重組犬CaIFN-α的方法。利用基因工 程表達技術,構建含有犬CaIFN-α基因的重組病毒,并利用家蠶作為宿主,表 達生產具有生物活性的重組犬CaIFN-α。

為了達到上述目的,本發明采用的技術方案其步驟如下:

1、一種家蠶生產重組犬CaIFN-α的方法:

(1)CaIFN-α基因的克?。阂哉憬‘數丶胰难毎樘岬幕蚪MDNA 為模板,利用PCR技術擴增得到犬CaIFN-α基因;引物設計如下:正向引物: 5’ggatcctgcc?acctgcccgac3’BamHI,含有BamHI酶切位點,反向引物: 5’aagctttcatttcctcctcct?g?3’,含有HindIII酶切位點;PCR反應的循環數、溫度和時 間的設計如下:一個循環,94℃模板變性3分鐘;以下30個循環,94℃變性 50秒,55℃退火30秒,72℃延伸2分鐘;最后1個循環,72℃延伸10分 鐘;利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產物分析,并用Qiagene的PCR純化試 劑盒純化,隨后將目的PCR產物克隆進Invitrogen公司的TA克隆3.9kb的載體 pCR2.1,利用雙脫氧鏈終止法在核苷酸測序儀上測序確認克隆CaIFN-α基因順 序正確性,并已登錄國際基因數據庫GenBank,登錄號DQ520882;

(2)含有犬CaIFN-α基因的重組桿狀病毒的構建:用限制性內切酶BamHI 和HindIII消化pCR2.1-CaIFN-α得到CaIFN-α基因片段,然后克隆入申請人 已經構建成功的家蠶Bacmid(專利號200310108781.8)的質粒pFastBacHT獲得 重組體pFastBacHT-CaIFN-α;將該質粒轉化入感受態大腸桿菌 DH10BmBacmid,通過細菌轉座子的作用在細菌內產生重組病毒基因組,通過 挑選重組白色菌斑,隨后抽提DNA,該DNA即為重組桿狀病毒基因組;然后 將該DNA與脂質體混合,并轉染入家蠶培養細胞BmN,用無血清的TC-100培 養基培養24小時后,換成含有10%胎牛血清的新鮮培養基,27℃培養5天, 收集培養基上清作為病毒儲存原液,然后通過再次感染細胞獲得高濃度的重組 病毒溶液,濃度為108pfu/ml。申請人犬將此重組病毒命名為BmNPV-CaIFN-α;

(3)家蠶體內表達和重組CaIFN-α純化:使用家蠶幼蟲5齡起蠶,接種上 述重組病毒進行感染表達;接種前,將幼蟲浸在冰水浴中麻醉10分鐘,注射用病 毒懸浮液濃度為106pfu/ml,采用皮下注射的方法,每條家蠶注射20μl,注射1 小時后給桑,在23-25℃下飼養;感染后的三天內,看不到明顯的癥狀,到第四天, 幼蟲開始食欲減弱,漸漸地呈現出感染癥狀;感染后地五天或第六天,感染的幼 蟲大部分死亡,在此之前收集家蠶幼蟲;

將幼蟲的血淋巴作為重組犬CaIFN-α純化的起始材料,使用以下方法收集 血淋巴:在15ml收集管的上方,將幼蟲向背面彎曲,用一只手固定幼蟲的頭部 和尾部,讓腹部和腹足伸向外邊。用石蠟膜密封的25號針頭刺破腹足收集血液, 讓血液直接滴進收集管中,為了防止血液氧化變黑,預先加入1/10體積的10 mmol/L二硫蘇糖醇DTT,使其終濃度為1mmol/L;

由于重組蛋白N-末端帶有6×His尾巴,可以用Ni-NTA親和柱在非變性條 件下進行蛋白純化;從感染的幼蟲收集的血淋巴用非變性結合緩沖液,Na3PO450mmol/L,NaCl?0.5mol/L,pH?8.0,進行稀釋;樣品隨后結合于Ni-NTA柱,最后, 重組蛋白用含有250mmol/L咪唑的非變性洗脫緩沖液洗脫,通過SDS-PAGE考馬 斯亮藍染色后鑒定重組蛋白;

(4)重組CaIFN-α活性分析鑒定:將純化的、倍比稀釋的重組CaIFN-α添加 到犬腎細胞(MDCK)單層培養細胞,作用18h,然后加入VSV病毒,同時設置陰 性對照組,24h后觀察細胞病變結果。根據結果分析判斷重組CaIFN-α的抗病毒 活性。

本發明與背景技術相比,具有的有益效果是:

本發明較好地解決了CaIFN-α在大腸桿菌中表達需要復雜的復性操作、酵 母表達中質粒轉化體不穩定和在哺乳動物培養細胞生產的成本太高的缺點,家 蠶幼蟲表達重組犬CaIFN-α具有較高的生物活性,且大部分被分泌進血淋巴 中,非常有利于蛋白質的快速提取。重組CaIFN-α可以大量生產為CaIFN-α 在醫學上的應用開辟了廣闊的前景。

具體實施方式

1、材料:DNA抽提試劑盒購于Qiagene。DNA處理和PCR擴增試劑盒購 于Takara?Biomedicals(Kyoto,Japan)。TA克隆試劑盒、桿狀病毒轉移載體 pFastBacHT、lipofectin和Ni-NTA樹脂均為Invitrogen公司產品。DNA測序 試劑盒購于PE?Applied?Biosystems。胎牛血清FCS、家蠶BmN細胞培養基 TC-100均為GibcoBRL的產品。本試驗使用家蠶雜交種,品種名稱為秋豐×白玉, 家蠶幼蟲桑葉飼養,溫度為23~25℃。

2、工作流程:

一種家蠶生產重組犬CaIFN-α的方法:

(1)CaIFN-α基因的克?。阂哉憬‘數丶胰难毎樘岬幕蚪MDNA 為模板,利用PCR技術擴增得到犬CaIFN-α基因;引物設計如下:正向引物: 5’ggatcctgccacctgcccgac3’BamHI,含有BamHI酶切位點,反向引物: 5’aagctttcatttcctcctcct?g?3’,含有HindIII酶切位點;PCR反應的循環數、溫度和時 間的設計如下:一個循環,94℃模板變性3分鐘;以下30個循環,94℃變性 50秒,55℃退火30秒,72℃延伸2分鐘;最后1個循環,72℃延伸10分 鐘;利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產物分析,并用Qiagene的PCR純化試 劑盒純化,隨后將目的PCR產物克隆進Invitrogen公司的TA克隆3.9kb的載體 pCR2.1,利用雙脫氧鏈終止法在核苷酸測序儀上測序確認克隆CaIFN-α基因順 序正確性,并已登錄國際基因數據庫GenBank,登錄號DQ520882;

(2)含有犬CaIFN-α基因的重組桿狀病毒的構建:用限制性內切酶BamHI 和HindIII消化pCR2.1-CaIFN-α得到CaIFN-α基因片段,然后克隆入申請人 已經構建成功的家蠶Bacmid(專利號200310108781.8)的質粒pFastBacHT獲得 重組體pFastBacHT-CaIFN-α;將該質粒轉化入感受態大腸桿菌 DH10BmBacmid,通過細菌轉座子的作用在細菌內產生重組病毒基因組,通過 挑選重組白色菌斑,隨后抽提DNA,該DNA即為重組桿狀病毒基因組;然后 將該DNA與脂質體混合,并轉染入家蠶培養細胞BmN,用無血清的TC-100培 養基培養24小時后,換成含有10%胎牛血清的新鮮培養基,27℃培養5天, 收集培養基上清作為病毒儲存原液,然后通過再次感染細胞獲得高濃度的重組 病毒溶液,濃度為108pfu/ml。申請人將此重組病毒命名為BmNPV-CaIFN-α;

(3)家蠶體內表達和重組CaIFN-α純化:使用家蠶幼蟲5齡起蠶,接種上述 重組病毒進行感染表達;接種前,將幼蟲浸在冰水浴中麻醉10分鐘,注射用病毒 懸浮液濃度為106pfu/ml,采用皮下注射的方法,每條家蠶注射20μl,注射1小 時后給桑,在23-25℃下飼養;感染后的三天內,看不到明顯的癥狀,到第四天, 幼蟲開始食欲減弱,漸漸地呈現出感染癥狀;感染后地五天或第六天,感染的幼 蟲大部分死亡,在此之前收集家蠶幼蟲;

將幼蟲的血淋巴作為重組犬CaIFN-α純化的起始材料,使用以下方法收集 血淋巴:在15ml收集管的上方,將幼蟲向背面彎曲,用一只手固定幼蟲的頭部 和尾部,讓腹部和腹足伸向外邊。用石蠟膜密封的25號針頭刺破腹足收集血液, 讓血液直接滴進收集管中,為了防止血液氧化變黑,預先加入1/10體積的10 mmol/L二硫蘇糖醇DTT,使其終濃度為1mmol/L;

由于重組蛋白N-末端帶有6×His尾巴,可以用Ni-NTA親和柱在非變性條 件下進行蛋白純化;從感染的幼蟲收集的血淋巴用非變性結合緩沖液,Na3PO450mmol/L,NaCl?0.5mol/L,pH?8.0,進行稀釋;樣品隨后結合于Ni-NTA柱,最后, 重組蛋白用含有250mmol/L咪唑的非變性洗脫緩沖液洗脫,通過SDS-PAGE考馬 斯亮藍染色后鑒定重組蛋白;

(4)重組CaIFN-α活性分析鑒定:將純化的、倍比稀釋的重組CaIFN-α添加 到犬腎細胞(MDCK)單層培養細胞,作用18h,然后加入VSV病毒,同時設置陰 性對照組,24h后觀察細胞病變結果,根據結果分析判斷重組CaIFN-α的抗病毒 活性。

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